三代全长转录组测序---Clontech SMARTer cDNA建库之首选
三代全长转录组测序
简介
PacBio Sequel的长读长可实现全长转录本测序，并使基因可变剪接形式的识别成为可能，因此可以对新基因及其Iso-form进行更全面的研究。同时，长读长不再需要对RNA-Seq的Reads进行组装，因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释，用以改进参考基因组中的基因注释信息。
技术流程
文库构建流程
PacBio Sequel系统使用的全长转录组建库有SMARTer?和SuperScript®两种方式。
1、使用Clontech公司的SMARTer® PCR cDNA Synthesis Kit（634925，634926，634928）进行建库时，PolyA+RNA最少需要1 ng，总RNA最少需要2 ng，同时采用Takara公司的全能酶Tks Gflex™ DNA Polymerase（R060A）进行扩增，是PacBio推荐的方案；
2、 采用Life Technologies（旗下Invitrogen）公司的SuperScript® Full-length cDNA Library Construction Kit进行建库，建库时间至少是SMARTer?的两倍，PolyA+RNA最少需要10 µg。
相比前代RS系列测序仪，Sequel系统在SMRT Cell片段长度偏好性方面已经有很大改进，4 kb以下的建库无需进行片段大小选择。目前Sequel系统一般采用SMARTer?建库方式。经过我们对仪器和试剂的调试，也推荐效率更高的SMARTer?建库方式。当然，如果想要追求更精准的研究结果，仍可采用分段建库的方式获得更好的测序结果，其流程可参考下图：
一般而言，对于初步研究一个物种的转录组序列情况通常推荐三个Cell的数据量（6 G），也就是建库片段长度1 ~ 2 kb一个Cell、2 ~ 3 kb一个Cell和3 ~ 6 kb测一个Cell。当然也有一些高分文章测了几十个Cell，此类文章中通常是对不同组织部位或者不同时间点的组织进行测序，由此增加了测序所需的Cell数。数据量可以根据样本电泳情况调整，多倍体建议数据量加大保证数据准确性。由于3' UTR + 5' UTR长度＞1 kb，所以不构建＜1 kb文库。
分析流程
数据分析内容
Iso-seq分析包含4个主要的步骤，分别是CCS，Classify，Cluster和Subset（可选）。
· CCS步骤：该步骤主要基于来自同一条Polymerase Read中的Subreads序列构建CCS序列。
· Classify步骤：该步骤通过分析CCS序列，输出两个文件。一个文件包含全长非嵌合体序列（Full-length Non-chimeric Reads）和非全长序列。在该过程中，Classify步骤会去除CCS序列中包含的PolyA/T Tails和Primer序列，去除污染序列，但是会保留PCR引起的嵌合体序列。
· Cluster步骤：该步骤基于全长非嵌合体序列和非全长序列，进行质量校正处理，生成Polished高质量的一致性序列和低质量一致性序列。
· Subset步骤：这是一个可选步骤，主要用于从输出文件中将指定类型的序列输出出来，比如非嵌合体Reads等。
转录组分析根据物种是否有已知的参考基因组和基因注释文件，分为有参转录组测序和无参转录组测序。无参转录组测序常常需要基于测序得到的Reads根据Overlap信息进行组装，得到Unigene并进行下面的分析。对于全长转录组测序来讲，根据物种是否有参，在分析策略上同意也分析有参和无参全长转录组测序。由于测序上的先进性，无参全长转录组测序分析时不用软件进行组装，只需要在进行初级质控后就可以进行注释。
无参转录组
主要包含序列特征鉴定和功能注释两大方面：
(1) 序列特征预测包含：CDS预测、SSR预测、lncRNA预测等；
(2) 功能注释包括：NR注释、Swissport注释、COG/KOG注释、GO注释和KEGG注释等。
*无参转录组测序不能做可变剪接分析。
有参转录组
对于有参全长转录组分析，因为加入了与参考序列比对，所以分析内容上相对无参转录组有很大提升。
本文来自欧意公司
