动物细胞培养方案与应用

动物细胞培养

按照动物细胞的来源将其培养于单层贴壁或悬浮条件下。

贴壁细胞需固着生长，在细胞培养容器内表面形成一层单细胞粘附层。这种粘附对于细胞增殖是必要的——许多贴壁细胞一旦相互接触便停止增值（例如在它们完全覆盖细胞培养容器表面的时候），并且如果相互接触时间过长，其中的一部分还会死去。来源于组织的大部分细胞都是固着生长的。

悬浮细胞无需粘附于基质即可生存和增殖。造血细胞（源于血液、脾脏或骨髓）以及一些转化细胞系和源于恶性肿瘤的细胞能够在悬浮状态下生长。

原代细胞、有限细胞系和传代细胞系的增殖潜力各不相同。不同的细胞类型之间生长行为和营养需求上的差异很大。对细胞培养条件的优化是必要的，这样能够确保细胞健康生长，并在最适条件下引入后续应用。

在参考资料1中可以获得关于细胞培养的详尽资料。

原代细胞培养

原代细胞培养物源自于组织块中长出的迁移细胞，或使用酶、化学试剂或机械法解离出的组织细胞。原代培养物是由组织解聚处理后存活下来的细胞所组成，它们粘附于细胞培养容器表面（或存活于悬浮相中）并进行增殖。

原代细胞的形态类似于它们的来源组织。这些培养物能够分裂有限代，随后进入一个称为衰老的非增殖状态，并最后死去。贴壁型原代细胞对于接触抑制十分敏感，即它们一旦相互汇合就停止生长。但当细胞密度较低时，正常表型就可以维持。原代细胞的培养一般比传代细胞系更为困难。

不过在某些时候人们在实验系统中更倾向于使用原代细胞培养物而非传代细胞系。这是因为原代细胞被许多研究者视为更接近于活体细胞的生理特性。此外，细胞系培养时间过长可能导致其表型和遗传型的改变，导致同一细胞株系在不同实验室中出现结果差异。而且，许多细胞类型无法建立传代细胞系。

有限细胞系

有限细胞系是由原代细胞培养物的第一次亚克隆（传代）所形成的培养物。这些培养物以有限的世代进行分裂增殖，之后开始衰老。一些人类有限细胞培养物的增殖潜力可以通过使用病毒转化基因（例如SV40转化——抗原基因）的导入进行延长。这些培养物的表型介于有限培养物和连续培养物之间。这些细胞会在一定的延长时间内增殖，不过通常它们最后会停止分裂，与老化的原代细胞类似。这类细胞在某些情况下比原代细胞培养物更容易操作，特别是对于稳定转染的克隆而言。

传代细胞系

有限细胞培养物最后将死去，或者获得稳定可遗传的突变从而变为连续传代细胞系，形成无限增殖的能力。这一改变通常被称之为体外转化或永生化，与肿瘤发生学密切相关。

无论是自然发生还是暴露于诱变剂进行人工，诱导啮齿类动物的原代细胞培养物都能够相对容易地形成连续传代的细胞系。与此相反，人类的原代细胞培养物很少以此类方式形成永生化（如果有过的话），并需要额外赋予遗传操作，才能形成连续传代细胞系。不过，源于人类肿瘤的细胞培养物经常是可不断增殖的。

连续传代细胞系通常比原代细胞或有限细胞系更容易操作。不过，应记住这些细胞的遗传已发生了改变，其体外行为有可能与在活体内有所区别。

动物细胞培养物的安全性和操作注意事项

法规和监管指南

在操作任何动物或人体组织（例如建立原代细胞培养物）之前，有必要确保该项工作的属性符合医学伦理学和动物实验的相关法规和准则。可能需向有关监管部门和/或个人寻求批准。

安全考虑与生物危害

当操作潜在的有害物质时，对材料或实验方案中可能存在的危害具有充分的认识十分重要。所有的细胞培养物都可能存在生物危害，因为它们都潜在地包含了传染物（例如病毒）。

其危险程度取决于所使用的具体细胞种类和实验方案。对于原代细胞培养物应特别小心地进行操作，因为这些培养物在带有未知病毒方面具有很高风险。尽管常用细胞系一般被认为不含传染物，但操作时仍需小心，因为它们还是可能含有如潜伏性病毒一类的传染物。用于研究特定病毒的细胞培养物，应假定其具有包含目的病毒时的同等危险程度。

我们建议将所有的实验材料按照潜在感染的标准进行操作，以此确保人们在最为安全的环境下工作。实验流程应在经验证的层流净化罩下，使用无菌技术进行操作，并避免气溶胶的产生。工作完成后，所有的废弃物和仪器（例如用过的烧瓶、枪头等）应该按照单位和地方的标准，通过高压灭菌法或在适当消毒剂中浸泡进行消毒。

处理细胞培养物

当对细胞培养物进行操作时，坚持良好的实验室操作规范是必要的，这主要有两个原因：首先，可以减少操作者被潜在传染物（可能不只一种）感染的风险；其次，避免细胞被细菌或其他动物细胞污染。

使用无菌操作技术和减少气溶胶的产生

正确使用实验室设备并进行无菌操作，在对细胞培养物的研究中是必需的。在开始工作之前，务必使用消毒过的仪器和试剂，并使用杀菌剂或70%乙醇清洗手、试剂瓶和工作台表面。

应避免气溶胶的产生，因为其存在吸入性危害，并可能导致培养物之间发生潜在的交叉污染。为了避免气溶胶的产生，请使用TD型（移液）的枪头，而不要使用TC型（存液）枪头；使用带有棉花塞的枪头；避免对液体进行快速的上下混合；不要过度用力地吹去枪头中的液体；使用枪头操作液体时尽量避免气泡的产生。避免从过高的位置向接受容器中吹出枪头中的液体。吹出液体时枪头尽可能靠近接收容器的页面，或使液体沿容器侧壁流下。

正确使用设备能有助于最大程度地减少气溶胶产生的风险。例如在使用离心机的时候，确保被离心的试管都被正确地密封，从而避免在管顶部产生液滴；使用带盖的离心机并密封其顶部以隔绝气溶胶污染。

层流净化罩

为了确保操作的最高效率，层流净化罩应位于实验室内最少受空气扰动影响的区域。避免在靠近门口、通风口或密集活动的位置放置层流净化罩。一般在专用的细胞培养室中放置层流净化罩。

小技巧：

• 请保持层流净化罩的洁净，并避免在罩内放置器材。
• 在开始操作之前，清洗罩内的工作表面以及每个瓶子的外表面（例如使用70%乙醇进行擦拭），之后将所有细胞培养的实验所需材料放置于罩内。
• 摆好仪器、枪头、废液缸和试剂瓶，让使用过的物品远离洁净物品，并避免一切将用过的物品经过洁净物品上方的操作。
• 将用过的物品（例如枪头）放在罩内的一个特定容器中，从罩内取出之前进行消毒或密封。

污染

微生物的存在可能抑制细胞生长和死亡，导致结果不一致。细胞培养的污染在新手和熟手身上均可能发生。

潜在的污染途径是多种多样的。不洁操作即可造成培养物污染，来源可能是被污染的培养基、试剂和器材（例如枪头），或培养箱、冰箱和层流净化罩中的微生物，也可能是操作者的皮肤或来源于其他实验室的培养物。

细菌、酵母、真菌类、霉菌、支原体及其他细胞培养物是动物细胞培养物中常见的污染物。为了预防发生污染造成细胞培养物的损失，我们建议冻存一部分培养细胞，这样在必要的情况下可以重新培养。

微生物污染

微生物污染的特征请参见表 微生物污染的特征。某些情况下传染物的存在可以通过培养物的浑浊，或培养基pH值的急剧改变（通常培养基的指示剂颜色会发生改变）以及细胞培养物的死亡判定。不过，某些污染不会造成培养物的浑浊，其不良影响也并不容易被发现。

细胞培养物应常规进行污染物的鉴定。支原体感染是比较常见并难以检测的感染物之一；对它们的检测和消除进一步详细描述如下。

微生物污染的特点

特点	细菌	酵母	真菌
pH的变化	多数感染导致pH值下降	严重感染导致pH值改变	有时pH值变化
介质浑浊：在显微镜下（100–400x）	细胞之间有闪光；可能观察到杆菌或球菌	圆形或椭圆形能够产生更小颗粒	细丝状菌丝体；有时有孢子团

支原体感染与检测

支原体是一类生长缓慢的微小原核生物，它们缺少细胞壁，经常污染细胞培养物。它们不像细菌和真菌那样受抗生素影响。而且，支原体不会长满整个培养容器，也不会造成培养物的浑浊。它们可能长期存在而不被察觉，很容易扩散到其他的细胞培养物当中。支原体污染的不良后果包括抑制细胞的代谢和生长，也会干扰核酸合成和细胞的抗原性。急性感染会导致整个细胞培养物的退化，有时出现一些明显的抗性克隆，但其实也被缓慢感染。检验支原体的存在主要由两种方法——Hoechst 33258染色（1,3）和支原体特异性的DNA探针。另外，ATCC或其他组织也提供基于PCR的支原体检测收费服务。

支原体感染的消除

最好的办法是通过高压灭菌或焚烧的方式，放弃使用被支原体慢性污染的培养物。只有当培养物绝对无法替代的时候才尝试对其进行消除。这一步骤应由经验人士在隔离的超净台中进行操作，最好该超净台位于一个独立房间，并且不用于细胞培养操作。支原体的消除一般是通过使用多种市售抗生素来完成的，可使用的试剂包括喹诺酮衍生物（Mycoplasma Removal Agent，支原体去除试剂），环丙沙星（Ciprobay），恩诺沙星（Baytril），以及泰妙菌素和米诺环素（BM–Cyclin）的混合物。处理步骤和适当的抗生素浓度参见厂商说明书以及参考资料1和3。

细胞系的交叉污染

对一种细胞培养物而言，存在着被另一种快速生长的细胞（例如Hela细胞）交叉污染的严重风险。为了避免交叉污染的发生，请使用正规细胞库提供的细胞系；同一时间内只在超净台内操作单一细胞系；针对不同的细胞系使用不同的枪头、试剂瓶和培养基容器；定期检查细胞，确保其具有正常的形态和生长特点。

细胞培养条件

培养基和血清

细胞培养基的选择极为重要，能够对细胞培养实验的成功与否造成显著影响。不同细胞类型具有各自特异性的生长需求，对于每种细胞类型的最适培养基需要通过试验确定。常见的基础培养基包括Eagle极限必需培养基（MEM）、Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）、RPMI 1640培养基和Ham F10培养基。它们都是包含氨基酸、葡萄糖、盐分、维生素及其他营养成分的混合物，市面上有多家厂商供应粉末或液体形式的这类培养基。

基础培养基通常在使用前加入血清、L型谷氨酰胺、抗生素和/或杀真菌剂，以配成完全培养基（成为生长培养基）。血清是一类包含生长和粘附分子的原料，成分并不完全清楚，对不同特定细胞类型生长方面的支持能力也差异很大。胎牛血清(FCS)是最为常用的血清，但对于某些应用来说，可使用更便宜的马血清或小牛血清。不同批次的血清应单独进行测试，以便找出对于特定细胞类型最为合适的一种。L型谷胱甘肽是一类不稳定的氨基酸，随时间逐渐转变成细胞无法利用的形式，因此应在使用前加入培养基。抗生素和杀真菌剂作为无菌技术的添加物，用来阻止微生物污染。常用抗生素和杀真菌剂的工作浓度请参见表 动物细胞培养的常用抗生素和动物细胞培养的常用杀真菌剂。某些细胞类型，特别是一些原代细胞，需要额外的添加剂（例如胶原和纤连蛋白、如雌激素一类的荷尔蒙，以及如表皮生长因子和神经生长因子一类的生长因子）帮助细胞成功贴壁和增殖。

培养基、血清和添加物在使用前，应于37°C下孵育48小时以进行消毒测试。如果孵育后发生了微生物的生长，该培养基和添加物应当弃之不用。

动物细胞培养的常用抗生素

来自参考文献4。

抗生素	工作浓度	作用微生物	在37°C的稳定状况
青霉素	50–100 U/ml	革兰氏阳性菌	3天
链霉素	50–100 µg/ml	革兰氏阴性菌	5天
卡那霉素	100 µg/ml	革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌；支原体	5天
庆大霉素	5–50 µg/ml	革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌；支原体	5天

用于动物细胞培养的常用杀菌剂

来自参考文献4。

抗体	工作浓度	作用微生物	在37°C的稳定状况
制霉菌素	100 U/ml	霉菌和酵母菌	3天
两性霉素B	0.25–2.5 µg/ml	霉菌和酵母菌	3天

孵育条件

培养细胞的孵育条件也同样重要。细胞培养物应该在对温度（如隔水式培养箱）和二氧化碳浓度具有严谨控制的培养箱中进行孵育。大多数细胞系需要在37°C和5% CO₂的饱和湿度条件下生长，但某些细胞类型需要较低的温度和/或较低的CO₂浓度。

细胞培养容器

培养容器的选择可能会对贴壁细胞的生长产生影响。市面上可以买到表面经过处理的无菌一次性培养皿和培养瓶，其处理过的表面能够保证动物细胞在上面良好地生长。

细胞库

对于某些细胞培养物，尤其是那些重要类型而言，比较常用的做法是保存于一个双份冷冻细胞库：一个主细胞库和一个工作细胞库。工作细胞库包含了主细胞库中的细胞样本，它们在储存之前已经培养生长了数代。如果需要调用该细胞样本，就从工作细胞库中取用。主细胞库只有绝对必要时才会使用。这能够确保所保存原始细胞的分裂数达到最低，并避免其在培养过程中发生遗传变异。

培养物的不稳定性

重复进行传代培养的细胞的生长率有时会发生不可预期的减少，而如转染过程等操作过程中的细胞毒性又会意外增加。这种不稳定性可归因于细胞培养条件的变化，基因组变异以及细胞群体中某一组分选择性的过度生长。我们推荐使用低传代数的细胞（少于十个分裂周期）。为了预防在连续传代细胞系中发生不稳定的现象，避免有限细胞系中发生衰老或转化作用，并在转染实验中保证一致性，我们建议通过冻存一部分细胞建立细胞库，以便在可能的必要时刻重新进行复苏培养。

动物细胞培养的基本方案

细胞培养物的维持

建立和维持动物细胞培养物需要在培养基的配制、加入和传代过程当中使用标准化的操作。培养物需定期检查污染情况，并决定是否需要继续换液和传代。

下列细胞培养规程来源于下列资料：动物细胞培养：基本技术手册（Manual of Basic Technique，[1]），当今分子生物学实验方案（Current protocols in Molecular Biology [4]），和细胞：实验室手册（Cells :a Laboratory Manual [2]）。这些方案是对于普通细胞培养方法的实例，并没有被QIAGEN进行严格确证和优化。目前也存在许多正在使用中的替代方案。

重要：具有潜在生物危害性的材料（如细胞、培养基等）应在废弃前进行消毒处理，并按照您所在机构的相关准则进行丢弃。

细胞复苏

1. 在37°C水浴中进行加热，并预热细胞所需的生长培养基。
2. 将预热的生长培养基加入适当大小的细胞培养容器中。
3. 从液氮中取出一小瓶冻存细胞，并放置于水浴中直至解冻。
   重要：解冻液氮中储存的冻存管时请佩戴护目镜和手套。小管从液氮中取出时可能会炸裂。
   重要：细胞一旦解冻，立即进入第4步。将它们移至生长培养基之前不要让细胞变暖。
4. 使用70%乙醇或其他适当的消毒剂清洗冻存管外表面。
5. 轻柔吸取已解冻的细胞悬液，将其移至包含已预热生长培养基的细胞培养容器中。轻轻涡动容器使细胞与培养基充分混合。
   注意：某些情况下需立即除去DMSO，特别是对于悬浮细胞、原代细胞和敏感的细胞类型而言。在此种情况下，将解冻的细胞悬液吸入包含预热培养基的无菌离心管当中，在200 xg下离心2分钟，去除上清液并在新鲜的生长培养基中重悬细胞沉淀，之后再移至适当的细胞培养容器中。 
   重要：在细胞培养容器中彻底混匀细胞，确保其在整个容器内分布均匀。
6. 将细胞在其常用的生长条件下孵育过夜。
7. 次日更换培养基。

使用胰酶处理细胞

胰酶消化法是使用蛋白水解酶——胰蛋白酶将贴壁细胞从细胞培养容器表面解离下来的技术。这一方法在需要获取细胞时使用（例如传代、计数或用于分离核酸）。

1. 吸去并丢弃培养基。
2. 使用PBS缓冲液（磷酸盐缓冲盐溶液）或HBSS溶液（Hanks平衡盐溶液）洗涤细胞，再吸弃。重复该步骤。
   PBS或HBSS溶液的体积应该近似于培养细胞所使用的培养基体积。
3. 加入足够的预热1x胰蛋白酶–EDTA溶液，覆盖整个单细胞层，并震荡培养瓶/培养皿4–5次以充分结合。
4. 将培养瓶/培养皿放置于二氧化碳培养箱中，在37°C下孵育1–2分钟。
5. 从培养箱中取出培养瓶/培养皿，以手掌用力敲击培养瓶/皿的侧面，帮助细胞解离下来。如果细胞仍未脱离，将培养瓶/皿重新放回培养箱继续温育几分钟。
   重要：从培养箱中取出培养瓶/培养皿，以手掌用力敲击培养瓶/皿的侧面，帮助细胞解离下来。如果细胞仍未脱离，将培养瓶/皿重新放回培养箱继续温育几分钟。不要将细胞置于1x胰蛋白酶–EDTA溶液中过长时间。细胞被充分消化之前不要强迫细胞脱离培养容器，否则可能会发生聚团。
   过度生长的培养物、老化细胞及某些细胞系可能难于被胰蛋白酶消化。尽管增加胰蛋白酶的处理时间能够有助于解离剩余细胞，但某些细胞类型对胰蛋白酶非常敏感，接触时间延长可能导致这些细胞死亡。另外，某些细胞系能够抵抗这种消化而形成细胞团块。
6. 细胞一旦解离，使用含血清的生长培养基对细胞进行重悬。请使用含同等比例血清的培养基进行细胞培养。血清能够消除胰蛋白酶的活性。
7. 使用注射器针头轻柔地前后吹散细胞团块。 
   如果吹动过于剧烈，细胞将受到伤害。请确保吹动过程中无气泡产生。
8. 按照需要进行后续操作（例如传代、冻存、核酸分离等等）。

1x PBS

pH值应无需调整即为7.4。在室温下保存。

组分
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
4.3 mM Na2HPO4
1.47 mM KH2PO4

1x HBSS

pH值应无需调整即为7.4。在室温下保存。

组分
5 mM KCl
0.3 mM KH2PO4
138 mM NaCl
4 mM NaHCO3
0.3 mM Na2HPO4
5.6 mM D-glucose

1x trypsin–EDTA溶液

*将1x trypsin-EDTA溶液储存在–20°C下。小体积等分液可储存在2–8°C达1–2周。培养细胞中使用胰蛋白酶时需尽快操作，因为胰蛋白酶在37°C 下会降解，酶活性迅速下降。

组分
0.05% (w/v) 胰蛋白酶
0.53 mM EDTA
在钙和镁的盐溶液，如1x PBS或1x HBSS中溶解胰蛋白酶和EDTA。*

细胞传代

许多贴壁细胞培养物一旦相互接触即停止增殖（例如当它们完全覆盖细胞培养容器的表面），某些类型的细胞在接触过长时间之后将会死去。因此贴壁细胞培养物一旦相互汇集，就需要进行常规的传代操作；在此过程中一部分细胞被种植于一个新的细胞培养容器内。悬浮细胞将飞快耗尽他们的培养基，一旦细胞密度变得过高，这些培养物也即需要进行常规的传代操作。

重要：尽管常规的传代对于维系动物细胞培养物十分必要，但这一操作对于贴壁细胞还是具有相对压力的，因为在此过程中这些细胞会受到胰酶的消化。我们不建议在短于48小时的时间间隔内频繁进行传代操作。

1. 通过胰酶消化（贴壁细胞培养物）或在200 xg离心5分钟（悬浮细胞培养物）采集细胞。使用适当体积的已预热生长培养基（含血清）重悬细胞。 
   重悬过程所使用的培养基体积是基于所需的稀释比（参见第二步）和细胞培养容器的体积来确定的。如果使用体积过小，则难于精确吸取所需要的体积加入新培养容器。
   相反地，如果使用体积过大，新培养容器可能会被加入的细胞溶液所填满。
   在某些情况下，采集贴壁细胞之后对胰蛋白酶进行去除是必要的，特别是对于原代细胞和敏感的细胞类型而言。在200 xg下离心细胞5分钟，小心地吸去上清，并使用适当体积的预热培养基（含血清）对细胞沉淀进行重悬。
2. 将适当体积的重悬细胞液转移至含有已预热生长培养基的新细胞培养容器中。轻柔涡动容器使细胞和培养基充分混匀。
   重要：彻底混匀细胞，从而确保细胞在细胞培养容器中分布均匀。
   重要：某些细胞类型如果传代量过少，将不会存活。我们不建议对原代细胞、敏感细胞类型或衰老细胞使用高稀释比。
   对于贴壁细胞，我们建议在传代中加入足够数目的细胞，以培养物在一周左右时间重新长满为宜。这不仅让胰酶消化的时间最小化，也使培养的操作时间变得最短。
   在确定向新细胞培养容器中转移细胞的数量时，以细胞需要多少次分裂能够重新形成汇聚的角度进行思考，可能会有所帮助。例如如果传代一半细胞，那么只需分裂一次即可长满。如果转移四分之一的细胞数目，那么需要两次分裂，如此进行思考。如果培养物每30小时分裂一次，那么一周时间内可能需要约5次分裂才能够长满。因此1:32（1:25）的稀释比例对于在约一周时间内完成细胞汇合是比较合适的。在第一步当中，如果使用8 ml培养基重悬细胞，则应向新的细胞培养容器中转移0.25 ml细胞悬液。
3. 将细胞在其常用的生长条件下进行孵育。

细胞计数

使用血细胞计数器对细胞进行计数

有许多情况需要对细胞进行计数，例如为转染实验进行细胞种植培养时。可以使用血细胞计数器对细胞计数。一个血细胞计数器含有两个小室。每个小室被划分为9个主要的正方形区域（每个体积为0.1 mm³或1x10^–4 ml）。通过对已知深度（体积）的特定区域内的细胞进行计数，来确定细胞浓度。

这一方法也收录于参考资料1、2和4当中。请注意也可使用许多其他的方法。

1. 使用70%乙醇或其他适当的消毒剂清洁血细胞计数器表面，当心不要刮伤计数器中央区的表面。使用拭镜纸擦干计数器。
2. 清洁盖玻片并轻轻润湿其边缘，将其放置于血细胞计数器的凹槽和中央区上方后，轻轻压下。
   将盖玻片正确贴附于计数器之上以获得准确的小室深度，是十分重要的。通过观察牛顿环的出现（盖玻片与血细胞计数器玻璃表面之间的空气干涉所形成的明暗环）能够对盖玻片的正确放置进行确证。
3. 通过胰酶消化（贴壁细胞培养物，参见使用胰酶处理细胞）或在200 xg下离心5分钟（悬浮细胞培养物）采集细胞。使用适当体积的已预热生长培养基对细胞进行重悬。精确计数需要至少10⁶个/毫升的细胞浓度。
   小贴士：可能需要离心细胞并以较小体积进行重悬，已获得计数所需的细胞浓度。对于贴壁细胞，在胰酶处理之后制成单细胞悬液十分重要。细胞团块将会对计数造成困难和错误。
4. 将细胞悬液样本彻底混匀。使用枪头从盖玻片的一侧加入20 µl细胞悬液，以充满计数器的一个小室。重复该操作充满另一个计数小室。 
   两个计数小室中的细胞分布应均匀一致。细胞悬液是通过毛细作用进入盖玻片和小室之间的。
   细胞悬液刚好充满计数小室即可。吸去任何多余液体不会对盖玻片下的细胞样品产生干扰。
5. 将计数器置于显微镜下，使用10x物镜和10x目镜观察以3条线划出的大正方形区域。 
   对9个主正方形中的5个统计细胞总数。仅统计正方形上边线和左边线上的细胞，忽略与正方形下边线和右边线重叠的细胞。这能够避免将细胞重复计数两次。如果细胞密度过高，则需要对细胞悬液进行稀释，请注意选择合适的稀释比例。
6. 再对第二腔室进行统计，合计10个正方形区域。
7. 将10个正方形区域的细胞总数相加，得到10^–3 ml体积中的细胞数量。将得数乘以1000，获得每毫升的细胞个数。
   重要: 如果将原始细胞悬液稀释用于计数，还要乘以稀释比例以获得实际的每毫升细胞数。
8. 使用70%乙醇和蒸馏水依次清洁血细胞计数器和盖玻片，并使用拭镜纸擦干。

冻存细胞和对细胞活力的染色鉴定

对于某些细胞培养物，特别是贵重的种类，通常的做法是建立双份冷冻细胞库：一个主细胞库和一个工作细胞库。工作细胞库包含了主细胞库中的细胞样本，它们在储存之前已经培养生长了数代。需要调用该细胞样本时，就从工作细胞库中取用。主细胞库只有绝对必要时才会使用。这能够确保所保存原始细胞的分裂数达到最低，并避免其在培养物中发生遗传变异。

1. 查验细胞是否健康、未污染、且形态正常。
2. 在细胞冻存前24小时进行换液。
   贴壁和悬浮细胞培养物不宜以高浓度冻存。我们建议在细胞的对数生长期实施冻存。
3. 贴壁培养物：通过胰酶消化采集细胞，将其重悬与包含血清的培养基中，在200 xg离心5分钟，之后使用冷冻培养基以3–5x10⁶个/毫升的浓度重悬细胞。
   悬浮培养物：将细胞在200 xg下离心5分钟，以5–10x10⁶个/毫升的细胞浓度重悬于冻存培养基中。
   重要：含有DMSO（二甲亚砜）的冻存培养基有毒性，需小心操作。
4. 将1 ml细胞悬液（贴壁细胞约为3–5x10⁶，悬浮细胞为5–10x10⁶）转移至单个冻存管中。在冻存管上注明细胞系名称、日期、传代数和生长培养基种类。
   小贴士：冻存之前在冻存管上注明细胞密度也会对后续实验有所助益。这些标记将帮助在解冻后挑选最佳的复苏密度。
5. 将冻存管放在支架上，再安置于聚苯乙烯盒中（盒壁约厚15毫米），并衬以棉绒。将存储盒放于–80°C冰箱过夜。
   将细胞以1°C/分钟的速率进行冰冻是十分重要的。可使用具有冰冻速率控制能力的设备代替聚苯乙烯盒+棉绒的方法。
6. 次日快速将冻存管转移至液氮罐中，确保冻存管未发生解冻。

冻存培养基

大部分悬浮细胞被冷冻在含有DMSO的冻存培养基中。
在–20°C下储存

组分
生长培养基（RPMI、 DMEM等）含有10–20% FBS的 5–20%甘油或DMSO

活菌染色

台盼蓝染色法能够区分培养物中的存活（可增殖）和无活力细胞。这一染色法基于染料排斥原理，具有完整细胞膜的细胞能够排斥（即不被染色）染料，因此可看作是活细胞。

1. 通过胰酶消化（贴壁细胞培养物）或在200 xg离心5分钟（悬浮细胞培养物）采集细胞。使用适当体积的已预热生长培养基对细胞沉淀进行重悬，重悬的细胞密度为至少10⁶个/毫升。
2. 在0.1 ml细胞悬液中加入0.5 ml 0.4%（质量体积比）台盼蓝染料和0.3 ml PBS或Hank's平衡盐溶液（HBSS；参见表 1xPBS和 1xHBSS）。充分混匀，再静置1–2分钟。也可在0.4 ml生长培养基的细胞体系中直接加入0.4 ml台盼蓝染料。
   精确计数需要至少10⁶个/毫升的细胞密度。
3. 使用血细胞计数器对着色和非着色细胞进行计数。染为蓝色的细胞活力较差，非着色细胞的活力良好。活力细胞数目/总细胞数目=活力比率（%）

台盼蓝

在室温保存。

组分	量
台盼蓝	0.4 g
1x PBS或1x HBSS	100 ml

参考文献

1. Freshney, R.I. (1993) Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 3rd ed., New York: Wiley-Liss.
2. Spector, D., Goldman, R.R., and Leinwand, L.A., eds. (1998) Cells: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
3. Drexler, H.G. et al., eds. (1997) DSMZ Catalog of Human and Animal Cell Lines. 6th ed.
4. Ausubel, F.M. et al. eds. (1991) Current protocols in molecular biology. New York: Wiley Interscience.