PCR实验方案和应用

PCR准则

聚合酶链式反应(PCR)是K.Mullis和其合作者在1985年发明的，它给分子生物学和分子医学带来了革命性的影响。一些主要的研究领域，包括生物标志物发现、基因调控和癌症研究，不断地提出更多的要求，对当今的PCR计术提出了更高的挑战。这其中就包括对高通量、更高的实验灵敏性以及更可靠的数据分析的要求。实验的发展和评价，数据的可重复性，以及得到结果需要的时间，仍然是研究者所面临的主要问题。

PCR扩增是一种常规的技术，目前已经发展了数以千计的PCR实验方案，但是研究者仍然会遇到PCR实验的技术困难，并经常不能获得特异性的PCR产物。尽管也有几种其它的挑战（比如，脱尾，低产率和非特异性扩增），PCR失败或者结果较差的原因主要有两个：反应的特异性和模板的二级结构。

PCR既是一个热动力学过程也是一个酶催化过程。成功的real-time PCR，需要在最佳的条件下进行扩增和检测，每一个反应成分都会影响结果。退火步骤对PCR反应的特异性非常关键。如果引物能够与模板高度特异性的结合，则会提高特异性的PCR产物，并且增强扩增反应的灵敏性。但是由于反应中较高的引物浓度，引物可能会与非互补的序列杂交，发生错配。如果引物与模板序列结合的特异性较低，可能会出现非特异性的PCR产物和引物二聚体。扩增反应中，预期PCR产物与假体的竞争，会降低特异性产物的产量，从而降低real-time PCR的灵敏性和线性范围。较低的PCR特异性，能显著的影响PCR的定量检测，特别是使用SYBR Green作为检测试剂的时候。由于SYBR Green能够与所有双链DNA序列结合，引物二聚体以及其它非特异性的PCR产物都会产生荧光信号。这导致反应整体灵敏度降低，并导致对目标转录物的定量不准确。PCR反应中，对反应的特异性至关重要的因素包括，引物设计和所使用的反应化学试剂。

PCR引物设计

最佳的引物序列和合适的引物浓度，对于PCR反应达到最大的特异性和最高的效率至关重要。表“引物设计和使用准则”提供了标准和多重PCR以及一步法RT-PCR反应中，引物设计和使用的概述。

引物设计和使用准则

	标准PCR	多重PCR	一步法RT-PCR
片段长度	18–30 nt	21–30 nt	18–30 nt
GC含量	40–60%	40–60%	40–60%
Tm信息	所有引物对应该具有类似的Tm值	所有引物对应该具有类似的Tm值。为了得到最佳的结果，Tm值应该在60–88°C之间。	所有引物对应该具有类似的Tm值。Tm值不应低于逆转录的温度（比如，50°C）
估计最佳退火温度	比计算的Tm值低5°C	比计算的Tm值低5–8°C（当Tm高于68°C时）或者比计算的Tm值低3–6°C（当Tm在60–67°C之间时）	比计算的Tm值低5°C
位置	–	–	为了避免检测到gDNA：引物应该与一个外显子的3’端和相邻外显子的5’端杂交。 或者引物应该与覆盖至少一个内含子的区域杂交。 如果仅知道mRNA序列，引物的结合位点应该相距300–400 bp。
浓度，与A260的单位吸光度对应的浓度相当	20–30 µg	20–30 µg	20–30 µg

PCR引物转化为摩尔

引物长度	pmol/µg	20 pmol
18mer	168	119 ng
20mer	152	132 ng
25mer	121	165 ng
30mer	101	198 ng

在设计PCR引物的时候，应该考虑如下因素，并且这些因素对于所有类型的PCR都适用：

• T_m值计算：2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)
• 避免引物对3’端的2–3个碱基互补
• 避免引物3’端与模板错配
• 避免引物的3’端出现3个或者更多个C或者G
• 避免引物序列本身互补和引物对之间互补
• 避免3’端的末端碱基是T
• 确保引物序列对于模板序列是独特的
• 每个引物的浓度应该在0.1–1.0 µM。对于很多应用而言，0.2 µM 的引物浓度就足够了

冻干的引物应该在少量的蒸馏水或者TE中溶解，以制备浓缩的原液。制备浓度为10 pmol/µl的若干等分工作溶液，以避免重复冷冻和融解。所有的引物溶液储存在 –20°C条件下。使用变性的聚丙烯酰胺凝胶来检测引物的质量，应该仅观察到一个条带。

PCR的条件

对于每个引物对，都应该优化PCR缓冲溶液中的引物和Mg²⁺浓度以及反应的退火温度，以高效率的进行PCR反应。除此之外，一些能增强DNA聚合酶的稳定性和续进性，或者通过降低非特异性的引物–模板相互作用而增强杂交的严格性的添加剂，也能改善PCR反应的效率(1)。使用高纯度的反应试剂，对于PCR反应的成功非常关键，特别是对于稀有模板的扩增反应，比如，基因组DNA中的单个拷贝的基因或者从被感染的生物体中分离出来的基因组DNA上的病毒DNA序列。
对照反应对于监控PCR反应的成功是非常必要的。在任何可能的情况下，都应该使用阳性对照，来确保使用的PCR的反应条件能成功的扩增目标序列。由于PCR是一种灵敏性极高的技术，仅需要目标模板的几个拷贝，因此，一定要使用不含模板DNA的阴性对照，来确保PCR使用的溶液没有被模板DNA分子所污染。

PCR反应应该与PCR分析在互相隔离的区域内进行，以确保PCR使用的试剂没有被PCR产物所污染。同样，分析PCR产物时使用的试管，绝对不能用于PCR反应。

引物退火的特异性与PCR缓冲溶液

在PCR反应中，引物与模板上互补的DNA序列发生退火。对于成功的扩增，引物退火必须具有特异性。为了在较短的退火时间内有效的杂交，引物的浓度必须很高，这会导致引物与非互补的序列退火。非特异性退火所产生的扩增产物，能够与特异性的扩增竞争，并极大的减少特异性产物的产量。

成功的PCR反应，需要维持较高的引物分子特异性退火和非特异性退火的比例。退火主要受到PCR缓冲溶液的成份（特别是阳离子）和退火温度的影响。特殊的阳离子组合，能在较大的退火温度范围内保持较高的退火特异性。这使得不再需要对于每一种引物–模板体系都优化退火温度，并且允许使用具有不同的引物退火温度的非理想的PCR实验。

退火温度

最佳的引物退火温度取决于碱基的组成（即A、T、G、C核苷酸的比例）、引物浓度和离子反应环境。

镁离子的浓度

镁离子是DNA聚合酶重要的辅助因子，对于酶的活性非常关键。Mg²⁺与扩增反应中的DNA，引物和核苷酸相结合。Mg²⁺的浓度通常要高于dNTP和引物，并且针对于不同的模板和引物，其浓度需要进行优化。如果Mg²⁺的浓度高于最佳浓度，那么会稳定非特异性的结合，从而导致特异性的PCR产物的产量降低，并且导致其它PCR假体和背景脱尾的出现。

PCR添加剂

有多种PCR添加剂或者增强剂能改善PCR的结果。这些试剂通过解除DNA的二级结构（比如，高GC含量的区域或者长扩增产物上的二级结构），降低模板的解链温度，增强酶的续进性，稳定DNA聚合酶或者阻止聚合酶黏附到塑料耗材上，发挥作用。

常用的PCR添加剂包括二甲基亚砜(DMSO)、牛血清蛋白(BSA)和甘油。

简并引物设计和使用准则

如果靶标的精确核苷酸序列未知，则通常可从氨基酸序列推断PCR引物序列。然而，由于遗传密码的简并性，推断的序列可能在一个或多个位点出现变异。在这些情况下，一种常见的解决方法是使用简并引物，它是在可变位点由具有不同碱基构成的相似引物的混合物。使用简并引物可导致PCR测定优化困难：在简并引物混合物中仅有有限数量的引物分子与模板互补；引物序列的解链温度(T_m)可以显著不同，而某些引物的序列可以与其他引物序列互补。由于这些原因，扩增条件必需最大限度地减少非特异性引物–模板和引物–引物相互作用。设计和使用简并引物时，以下准则可能会有所帮助。

引物序列：

• 避免3'末端3个核苷酸的简并性，例如，如果可能的话，使用蛋氨酸或色氨酸编码三联体的3'末端
• 为了增加引物–模板的结合效率，通过允许引物和模板之间的一些错配以降低简并性，特别是对5'末端，而不是3'末端
• 尝试在任何给定的位点以小于4倍简并性设计引物

引物浓度：

• 以0.2 μM引物浓度开始进行PCR
• 如果PCR效率不高，则以0.25 µM为单位递增引物浓度直到得到满意的结果

长PCR产物的扩增

使用非特异性的引物退火，未达最佳标准的循环条件以及二级结构的DNA模板受到损害等都可造成PCR扩增产物长度超过3–4 kb。通过改变各种因素（例如循环条件、引物和dNTP的浓度以及特殊添加剂等）对冗长的序列进行优化通常是必要的。

优化循环条件

在标准PCR中脱嘌呤化通常不是问题，虽然它可以显著影响长PCR片段的扩增。这是因为长模板脱嘌呤化比例高于短模板。由于这个原因，相较于变性步骤为30秒或1分钟，只有10秒的变性步骤可以得到更高的产率并且无背景污染（这会导致PCR失败）。在最后延伸步骤也观察到广泛的脱嘌呤化。因此，延伸温度为更低的68°C而非72°C时，可以大幅度提高长扩增产物的产量。

长PCR产物理想的循环条件请见下表。

长PCR产物扩增的循环条件

* 比引物的Tm低5°C。

步骤	时间/循环	温度
初始活化阶段	2 min	95°C
3步循环
变性	10 s	94°C
退火	1 min	50–68°C*
延伸	1 min/kb
循环数	40个循环	68°C
PCR循环结束	无限	4°C

优化PCR添加剂

发夹环状结构等二级结构往往是由富集GC模板延伸，长PCR产物高效扩增受到干扰造成的。这个问题可以通过添加试剂改变DNA解链方式以帮助解决低温下的二级结构来克服。

优化3'到5'核酸外切酶活性

复制模板时，相比所谓的标定DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶会引入更多的错配到PCR产物中。一旦在合成过程中发生错配，Taq DNA聚合酶将延伸错配的链或脱离模板链，从而分别导致突变或PCR产物不完整。虽然这在扩增短PCR片段时通常不会影响PCR效率，但是长PCR产物的扩增可以通过DNA合成过程中引入错配而受到显著影响。

校对DNA聚合酶包含一种内在的3'到5'核酸内切酶活性，可以去除错配的碱基对。加入少量的校对DNA聚合酶到PCR反应混合物中，可以显著提高长PCR产物的扩增效率。

用于PCR的酶

数种类型的热稳定DNA聚合酶都可在PCR中使用，这里我们提供了酶性质的选择，请参阅表“用于PCR的DNA聚合酶 ”。

分离自真细菌属水生栖热菌的Taq DNA聚合酶，是标准终点定量PCR最常用的酶。这种酶的稳健性使其可以在许多不同的PCR测定中使用。然而，由于这种酶是在室温下具有活性，其反应准备有必要在冰上进行，以避免发生非特异性扩增。

许多原来的“PCR聚合酶”需要进行修饰才能使用，但是现在Taq DNA聚合酶无需修饰即可用于不同的下游应用，如热启动、单细胞、高保真或多重PCR。万分之一个核苷酸的平均错配率使得Taq DNA聚合酶和它的变种的精确度不如B族耐热DNA聚合酶。但是，由于它的多功能性，Taq DNA聚合酶仍然是当涉及到严格的热启动时常规应用最多选择的酶，适用于多种高难度的PCR应用。

用于PCR的DNA聚合酶

来自参考文献2。

酶的性质	DNA聚合酶家族A	DNA聚合酶家族B
可用的酶	Taq DNA聚合酶	校正酶
5'–3'核酸外切酶活性	+	–
3'–5'核酸外切酶活性	–	+
延伸速率（核苷酸/秒）	~150	~25
错配率（per bp/per cycle）	1 in 103/104	1 in 105/106
PCR应用	标准、热启动、逆转录、real-time	高保真、克隆、定点诱变
A-addition	+	有时

热启动DNA聚合酶

在室温下进行扩增反应准备时，引物可非特异性地相互结合，形成引物二聚体。在扩增循环中，引物二聚体可以扩展并产生非特异性产物，从而降低了特异性产物的产率。对于那些高难度的PCR应用，热启动PCR对特异性结果至关重要。为了产生热启动DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶活性可在较低温度下用抗体，或者通过更有效的化学修饰，与所述聚合酶的氨基酸形成共价键的方式来进行抑制。化学修饰导致聚合酶完全失活，直到所形成共价键在最初的热活化步骤被分解。与此相反，抗体介导的热启动步骤，抗体通过相对较弱的非共价力结合聚合酶，这使某些聚合酶分子仍处于激活状态。这有时会导致可在PCR过程中被进一步扩增的非特异性引物延伸产物的出现。在琼脂糖凝胶上电泳时，这些产物就会呈现出背景污染或成为尺寸大小不正确的片段。

高保真DNA聚合酶

与标准的DNA聚合酶（如 Taq DNA聚合酶）不同，高保真PCR酶通常具有去除错误掺入碱基的3'到5'外切酶活性。高保真PCR酶非常适合于要求低错配率，如克隆、测序和位点定向诱变的应用。然而，如果该酶没有热启动功能，3'到5'外切酶活性可以在PCR准备过程和PCR的早期阶段中降解引物。缩短的引物造成的非特异性引发将会导致凝胶上的背景污染或者扩增失败，尤其是当所使用模板较少时。应当指出的是，校对功能往往导致高保真酶比其它DNA聚合酶起效更慢。此外，直接UA–或TA–克隆所需的A–addition功能将强烈降低，导致钝端克隆需要具有较低的连接和转化效率。

PCR循环

从理论上说，在反应中每个PCR循环将扩增子的量扩大到两倍。因此，10个循环后的量为约1000因子乘以扩增子的量，以此类推。

每个PCR循环都包括模板变性、引物退火和引物延伸等阶段。如果某个温度下退火和延伸是相似的，则这两个过程可以组合。循环的每个阶段，对于每个模板和引物对组合而言，都要对其反应时间和温度进行优化。

达到循环所需数量之后，扩增产物可以在下游应用中被分析或使用。

PCR循环数确定准则

1 kb DNA片段的量	E. coli DNA的量	人类DNA的量	单拷贝基因数量	PCR循环数
0.0.1–0.11 fg	0.05–0.56 pg	36–360 pg	10–100	40–45
0.11–1.1 fg	0.56–5.56 pg	0.36–3.6 ng	100–1000	35–40
1.1–5.5 fg	5.56–278 pg	3.6–179 ng	1 x 103–5 x 104	30–35
>5.5 fg	>278 pg	>179 ng	>5 x 104	25–35

PCR常用术语

在数据分析中使用的基本术语如下。有关数据分析的更多信息，请参阅real-time PCR厂商建议。数据显示为S形的扩增曲线（使用线性标度时），其中荧光值对循环数量绘图。

之前的目标核酸水平可以在real-time PCR中进行定量，分析原始数据并设置基线值和阈值。当不同的探针被用在单次实验中（例如当平行分析几个基因或当所使用探针携带不同标记染料），必须为每个探针调整基线与阈值的设置。

此外，使用SYBR Green检测方法分析单次实验不同的PCR产物时，需要为每个单独的检测调整基线和阈值。

基线：基线是早期循环的噪点水平，通常在第3和第15循环之间测量，这是因为在此期间还检测不到扩增产物引起的荧光值增加。用于计算基线的循环数量是可以改变的，如果使用高模板量或者靶标基因的表达水平高则循环数量需要减少。设置基线需要查看线性度扩增曲线的荧光数据。设置基线，使得扩增曲线的增长所开始的循环圈数大于基线循环最高圈数。对每个靶标序列都需要单独设置基线。早期循环检测到的平均荧光值需要从扩增产物中获得的荧光值中减去。各种real-timePCR软件的最新版本允许单个样品自动优化基线设置。

本底：是指反应中的非特异性荧光值，例如，低效率的荧光淬灭，或由于使用SYBR Green造成的大量双链DNA模板。信号的本底分量由real-time PCR软件算法数学除去。

报告基因信号 ：在real-time PCR过程中由SYBR Green或荧光标记的序列特异性探针产生的荧光信号。

归一化报告信号（RN）：这是报告染料荧光强度除以在每个循环中测量的被动参照染料的荧光强度。

被动参比染料 ：在某些real-time PCR中，荧光染料ROX被用作荧光信号标准化内部参照。它可以逐孔校正因校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。

阈值：阈值调整到本底值之上并显著低于扩增曲线的平稳值。它必须处于扩增曲线的线性区域内，代表了PCR检出的对数线性范围。阈值应在对数扩增曲线视图中进行设置，以使PCR的对数线性期易于识别。如果real-time PCR中有多个目标基因，阈值必须为每个目标进行设定。

循环阈值(C_T)或交叉点（CP）：扩增曲线穿过阈值的循环（即，荧光检测值显著增加的点）。C_T可以是一个分数，并且可以计算起始模板量。

ΔC_T值： ΔC_T值描述了靶标基因和相应的内参基因CT值的差值，例如看家基因，并用于标准化模板的使用量：

• ΔC_T = C_T (靶标基因) – C_T (内源性参比基因)
• ΔΔC_T值：ΔΔC_T值描述了感兴趣样品（例如，刺激细胞）的平均ΔΔC_T值与参考样本（例如，未刺激细胞）的平均ΔΔC_T值之间的差值。参照样品也被称为校准样品，并且所有其它样品进行相对定量时都将被标准化到如此：
• ΔΔC_T = 平均ΔC_T (感兴趣样品) – 平均ΔC_T (参比样本)

内源性参比基因：e这种基因的表达水平在样品间不存在差异，例如看家基因(3)。对比内参基因与靶标基因的C_T值可以将靶标基因的表达水平归一化到输入的RNA或cDNA的量（见上面关于ΔC_T值部分）。反应中模板的确切数量不确定。内参基因对以下情况作出校正：可能的RNA降解或RNA样品中存在酶抑制剂的情况，以及RNA含量、逆转录效率、核酸回收和样品处理的变动。为了选出最优的参照基因（多个），我们对算法进行了改进，允许其选择依赖于实验设置最优参照（4）。

内参：在同一反应中被作为靶序列扩增的，并用不同的探针（即，进行双重PCR）检测的对照序列。内参经常被用来排除失败的扩增，例如没有检测到目标序列的情况。

标定样品：在相对定量中使用的参比样品（例如，源自细胞株或组织纯化的RNA），用以与所有其他样品进行比较，以确定某一基因的相对表达水平。标定样品可以是任何样品，但通常是一个对照品（例如，未处理的样品或来自实验零时的样品）。

阳性对照：使用已知量模板的对照反应。阳性对照通常用来检查引物集或引物–探针集工作是否正常，以及反应是否正确设置。

无模板对照（NTC）：包含除模板之外的所有扩增反应所必要组分的对照反应。这使得发现由于污染的试剂或外源DNA造成的污染成为可能，例如从以前的PCR中。

无RT对照： RNA制备物可能含有残留的基因组DNA，如果检测不被设计为仅检测和扩增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中进行检测。DNA污染可以通过操作在其中没有加入逆转录酶的RT对照反应来进行检测。

标准品：已知浓度或拷贝数，用于构建标准曲线的样品。

标准曲线：要生成标准曲线，C_T值/不同标准稀释的交叉点对标准物质输入量的对数绘图。标准曲线通常是使用至少5种不同浓度的标准稀释倍比生成。每个标准曲线，应检查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之间。标准是各浓度一式三份的理想测定值。标准曲线的斜率如果与这些值差异较大则应该舍弃。

效率和斜率：标准曲线的斜率提供了对real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示该PCR具有数值为1的效率，或100％的效率，并且PCR产物的量在每个循环增加到两倍。效率小于–3.322（例如，–3.8）则表示PCR的效率<1。通常，大多数扩增反应因为实验的限制不能达到100％的效率。斜率大于–3.322（例如，–3.0）表明PCR效率似乎是大于100％的。当在反应中的非线性期对值进行测量时可能发生这种情况，或者它可以指示是否有抑制剂存在。

real-time PCR检测的效率可以通过分析一个模板稀释系列来计算，C_T值对模板量对数进行绘图，并确定最终标准曲线的斜率。从斜率（S），效率可以用下面的公式计算：PCR效率(%) = (10(–1/S) – 1) x 100

Real-time PCR

Real-time PCR与RT-PCR（也称为定量PCR或qPCR）能够对DNA、cDNA和RNA靶标的起始数目进行精确定量。该方法在每个反应循环中对所发出的荧光进行测定，随着反应的动态范围极大地增加，其伴随产生的荧光与PCR产物之间也成比例的增加。PCR产物能够通过与双链DNA结合的荧光染料，或通过具有荧光标记的序列特异性探针进行检测。

何为SYBR Green PCR？

SYBR Green I荧光染料能够结合双链DNA分子，并伴随结合反应的发生在固定波长发出荧光信号。SYBR Green I染料的激发和发射光谱分别为494 nm和521 nm，这使得该染料能够相容任何种类的实时荧光定量PCR仪。对PCR产物的检测是在real-time PCR的扩增期进行的。伴随着反应循环数的增加，荧光信号强度也由于PCR产物的积累而逐渐增加。使用SYBR Green染料能够实现对许多不同种类靶标的分析，而无需合成靶标特异性的标记探针。不过，非特异性的PCR产物和引物二聚体也会发出荧光信号。因此，使用SYBR Green染料时需要高度的PCR反应特异性。

何为基于探针的PCR？

荧光标记探针提供了一种高灵敏度的检测方法，在该方法中只有目的PCR产物才会得到检测。不过，PCR反应的特异性对于序列特异性探针的使用也同样重要。扩增反应中的人为干扰，如非特异性的PCR产物和引物二聚体也可能伴随性地生成，导致目的PCR产物丰度的降低。特异性产物与反应中的人为干扰物之间存在对反应成份的竞争，这会降低分析的效率和灵敏度。以下类型的化学探针经常被使用。

TaqMan探针: 序列特异性的寡聚核苷酸探针，带有一个荧光基团和一个淬灭基团。荧光基团偶联于探针的5'端，淬灭基团则附于3'端。在PCR的结合退火/链延伸期，探针被Taq DNA聚合酶的5'–3'的核酸外切酶活性所切断，导致荧光基团与淬灭基团的分离。从而生成了与积累的PCR产物数量成比例的可检测荧光。.

FRET探针：在使用荧光能量共振转移（FRET）探针的PCR反应中，两个已标记的寡聚核苷酸探针分别以头尾相接的形式结合至PCR产物上。当两个探针同时结合到PCR产物上时，它们的荧光基团足够接近，导致能量从供体荧光基团转移至受体荧光基团。因此，在PCR反应的退火阶段能够产生与PCR产物数量成比例的荧光。由于FRET系统中使用了两条引物和两条探针，因此良好设计的引物和探针的是获得成功结果的关键。

在real-time PCR中作为荧光探针的染料：需对real-time PCR中所使用的序列特异性探针进行标记时，有多种多样的荧光染料可供选择，每一种染料都有其特定的激发峰值和发射峰值。广泛可选的染料使得多重real-time PCR技术成为可能（同一反应中检测两个乃至更多的扩增子）：所选择染料的激发光谱能够与实时定量PCR仪的检测范围相容（不冲突），而它们的发射光谱又能够充分地相互区别。因此，当进行多重PCR时，最好使用波道间距最宽的那些染料，以尽可能避免发生任何潜在的交互信号干扰。

其他探针：许多探针供应商研发了他们自主专利的染料。需要更为详尽的资料，请参阅供应商各自的主页。

定量real-time PCR中常用的染料

*发射光谱根据缓冲条件而变化。

染料	最大激发光波长(nm)	最大发射光波长(nm)*
荧光素	490	513
Oregon Green	492	517
FAM	494	518
SYBR Green I	494	521
TET	521	538
JOE	520	548
VIC	538	552
Yakima Yellow	526	552
HEX	535	553
Cy3	552	570
Bodipy TMR	544	574
NED	546	575
TAMRA	560	582
Cy3.5	588	604
ROX	587	607
Texas Red	596	615
LightCycler Red 640 (LC640)	625	640
Bodipy 630/650	625	640
Alexa Fluor 647	650	666
Cy5	643	667
Alexa Fluor 660	663	690
Cy 5.5	683	707

PCR定量检测

靶标核酸可以通过绝对定量法或相对定量法来进行量化。

绝对定量法能够确定靶标核酸的绝对数量（表示为拷贝数或浓度），而相对定量法作为分析的第一步，能够表明靶标数量与参照（例如一个内源性对照分子，通常为一个合适的看家基因）数量之间的比例。之后即可使用这个标准化数值来进行比较，例如，进行不同样本中不同基因的表达水平之间的比较。

何为绝对定量？

使用外部标准将基因表达水平确定为绝对拷贝数值。对于基因表达分析，最为精确的标准物是已知拷贝数或浓度的RNA分子。基于靶标的序列和结构以及逆转录的效率，（通常情况下）RNA样本中只有一部分靶标RNA能够完成逆转录。逆转录过程中生成的cDNA随后将在real-time PCR作为反应模板。RNA标准品的使用也需要考虑到逆转录的可变效率。

可以使用5个不同浓度的标准品梯度稀释产物来创建标准曲线（C_T值/不同标准稀释液的交点相对标准品丰度的对数值进行作图）。未知靶标的数量应位于所测试的区间内。标准稀释品和靶标序列的扩增反应应于独立的反应孔内进行。首先确定标准品的C_T值。之后将未知样本的C_T值与标准曲线进行比较，以确定未知样品中的靶标数量。为需要定量的核酸种类选择适当的标准品是十分重要的。作为标准品核酸，其拷贝数或浓度必须已知。此外，标准品还需具备以下特征：

• 引物和探针的结合位点与需定量的靶标一致
• 引物结合位点之间的序列与靶标序列一致或高度相似
• 扩增序列的上下游序列与“天然”靶标一致或相似
• 标准品和靶标分子具有相同的扩增效率

用于绝对定量的RNA标准品

RNA标准品可以通过将目的转录本部分或全部地克隆至一个标准载体中来获得。插入片段可以源自总RNA或mRNA样本的RT-PCR反应，或通过PCR反应扩增cDNA来获得。克隆载体必须包含一个RNA聚合酶的启动子，例如T7、SP6或T3。请确保插入物的体外转录能够生成有义链转录本。体外转录反应之后，必须使用不含RNase的的DNase降解质粒DNA，因为残余的质粒DNA将会在分光光度测定RNA浓度的过程中造成错误，并在后续的PCR反应中充当（错误的）模板。而且，请在凝胶或毛细管电泳中验证标准品RNA作为一单独条带进行移动，以确保其不含任何降解产物或异常转录本。

通过分光光度计测定RNA的浓度之后，标准RNA分子的拷贝数可以按照以下公式进行计算：

（X g/µl RNA/[核酸转录本长度x340]）x6.022x10²³=Y分子个数/µl

使用体外转录物作为RNA标准品的另一替代方法是使用确定的RNA制备物（例如源自细胞系或病毒的制备物），这类RNA标准品中靶标的绝对浓度是已知的。

用于绝对定量的RNA标准品

质粒DNA：最为常见的建立DNA标准品的方法是向标准载体中克隆一种PCR产物。该法的优势在于能够方便地制备大量标准品，其同一性可以通过测序进行确证，而这些DNA也能够通过分光光度测定法容易地进行定量。用于扩增的质粒标准品应该是靶标序列上游或下游的线性化片段，而非超螺旋化质粒。这是因为线性化质粒的扩增效率通常不同于超螺旋化构象的质粒，前者能够更好地反映基因组DNA或cDNA的扩增效率。

当使用分光光度法测定质粒DNA的浓度之后，标准DNA分子的拷贝数可以按照下列公式进行计算：

（X g/µl DNA/[质粒的碱基对长度x600]）x6.022x10²³= Y 分子个数/µl

PCR片段：包含靶标序列的一条PCR产物也可作为DNA标准品。我们建议使用包含扩增子引物结合位点上下游至少20bp的PCR片段。可直接引用质粒DNA的计算公式（见上），将“质粒长度”换为PCR产物长度即可。

基因组DNA：如果感兴趣的靶标在单倍体基因组仅存一份拷贝，并且假基因和/或高度近似序列的扩增可以排除，则基因组DNA也可以作为绝对定量的DNA标准品来使用。如果该物种的基因组大小已知，那么可直接计算基因组中靶标的拷贝数。例如，小鼠的基因组大小（单倍体）是2.7x10⁹ bp，分子量为1.78x10¹²道尔顿。

那么1.78x10¹² g基因组DNA相当于6.022x10²³份单拷贝基因。

1 µg基因组DNA相当于3.4x10⁵份单拷贝基因。

何为相对定量？

在相对定量中，需要确定靶基因数量与参比基因（例如一个在所有样本中都存在的内参基因）数量之间的比值。该比值随后被用于不同样本之间的比较。在基因表达分析当中，看家基因或维持基因通常被选择作为内源性对照。同一样本中的靶标基因和参比基因，被分开进行扩增，或在同一反应中被共同扩增（多重real-time PCR）。对每一个样本确定标准化数值，举例来说，该标准化数值能够用于比较同一基因在不同组织中的差异表达情况，或对siRNA转染细胞与非转染细胞之间的基因表达水平进行比较。不过，内参基因的表达水平在不同实验条件或不同组织状态（例如“受刺激”与“未刺激”样本）中不能发生变化。当比较样本之间的基因表达水平时，受刺激细胞中靶标的表达水平可能相对于未刺激细胞高出100倍（举例来说）。靶标和内参基因以同等或不等的效率完成扩增，定量的结果将会不同。

测定扩增效率

两个基因（靶点A和B）的扩增效率可以通过从参考RNA或cDNA制备两个基因的梯度稀释样品来进行比较。每一梯度稀释样品都通过一步或两步法的real-time RT-PCR进行扩增，并以获得的CT值建立关于靶点A和B的标准曲线。每一靶点的扩增效率（E）可以按照以下公式进行计算：

E = 10^(–1/S) – 1 (S=标准曲线的斜率)

为了比较两个靶标序列的扩增效率，使用靶点B的C_T值减去靶点A的C_T值。再以C_T值之间的差值相对于模板量的对数进行作图。如果得到的直线斜率小于0.1，则可视为扩增效率相当。

不同的扩增效率

靶基因和内参基因的扩增效率通常是不同的，因为两者之间的引物退火效率，所扩增序列的GC含量以及PCR产物大小通常都存在差异。在这种情况下，例如使用对照细胞系的总RNA（标定或参考样品）时，需同时对靶基因和内参基因建立标准曲线。

由于PCR效率之间存在区别，因此所得结果的标准曲线将不会平行，即当模板量变化时，靶基因与参考基因之间的C_T值差异不会为常数。

不同扩增效率下的相对定量指南：

• 选择适当的内参基因，其表达水平在实验条件下或不同组织之间不应发生变化。
• 制备cDNA或RNA对照样本的倍比稀释样品（例如5或10倍的稀释比例），以建立靶基因和参考基因的标准曲线。
• 进行real-time PCR/RT-PCR反应。
• 确定标准品和目的样品的C_T值。
• 通过将C_T值（Y轴）相比模板量或稀释品的对数值（X轴）进行绘图，为靶基因和参考基因建立标准曲线。
• 使用C_T值及对应的标准曲线来计算样品中靶基因和参考基因的数量。
• 将靶基因的丰度值除以参考基因的丰度值，以对靶基因的数量进行标准化（如果反应重复多次，则应使用平均值）。
• 定义校验样本，并将靶基因的标准化数量除以校验样本的对应数值，来比较样品中靶基因的相对表达水平。

相当的扩增效率

如果靶基因与内参基因的扩增效率相当，则只对参考基因建立一个标准曲线即可。在这种条件下，当模板数量变化时，靶基因与参考基因之间C_T值的差异为一个常数。未知样本中靶基因与参考基因的丰度，通过将C_T值与参考基因的标准曲线进行比较来计算。

相当扩增效率下的相对定量指南：

• 选择适当的内参基因，其表达水平在实验条件下或不同组织之间不应发生变化。
• 制备cDNA或RNA对照样本的倍比稀释样品（例如5或10倍的稀释比例），仅为内参基因建立标准曲线。
• 进行real-time PCR/RT-PCR反应。
• 确定标准品和目的样品的C_T值。
• 将C_T值（Y轴）相比模板或稀释样品丰度的对数值（X轴）进行作图，为内参基因建立标准曲线。
• 使用C_T 值及标准曲线来计算样品中靶基因和参考基因的数量。
• 将靶基因的丰度值除以参考基因的丰度值，以对靶基因的数量进行标准化（如果反应重复多次，则应使用平均值）。
• 定义标定样本，并将靶基因的标准化数量除以校验样本的对应数值，来比较样品中靶基因的相对表达水平。

相对定量的比较法或ΔΔC_T法

另一种替代方法称为比较或ΔΔC_T法，该法基于对C_T值的直接比较。在初始实验中建立标准曲线只为确定靶基因和内参基因的扩增效率。在所有后续实验中，无需为靶标序列建立标准曲线。如果扩增效率相同，靶点的数量只需简单使用C_T值，以如下方法进行计算。

首先，通过计算靶基因与内参基因C_T值之间的差值来确定每个样品的ΔC_T值。每一未知样本及校验样本都需要确定该值。

• ΔC_T (样本) = C_T靶基因– C_T 参比基因
• ΔC_T (校验样本) = C_T 靶基因– C_T 参比基因

之后，通过使用样本的ΔC_T值减去校验样本的ΔC_T值，获得每一样本的ΔΔC_T值。

• ΔΔC_T = ΔC_T (样本) – ΔC_T (校验样本)

如果靶基因与内参基因之间的PCR效率相同，则靶基因表达水平的标准化值可通过下列公式进行计算：

• 样品中靶基因的标准化表达水平= 2^–ΔΔCT

不过，如果靶基因与内参基因之间的PCR效率不同，则该定量方法会导致对基因表达水平的错误估计。

该误差值是关于PCR效率与循环数的一个函数，可通过下列公式进行计算：

• 误差(%) = [(2ⁿ/(1+E)ⁿ) x 100)] – 100 (where E = PCR效率; n =循环数)

因此，如果PCR的效率不是1而是0.9，则25个循环之后结果误差可达261%。计算出的基因表达水平将比实际值低3.6倍。

小贴士： ΔΔC_T法仅适于靶基因与内参基因的PCR效率相同时使用，或在基因表达水平之间的差异足够大，可容忍结果误差的情况下使用。不过，该误差也可使用如Relative Expression Software Tool（REST；参见参考文献5）一类的效率校正计算程序进行修正。

使用ΔΔC_T 法进行相对定量的指南：

• 进行有效性试验，以确定靶基因和参考基因的PCR效率。
• 对源自不同样本的RNA中的靶基因和参考基因进行real-time RT-PCR。
• 通过将每一样本中靶基因的C_T值减去内参基因CT值，以获得ΔC_T值。
• 定义校验样品，通过使用每一样品的ΔC_T值减去校验样品的ΔC_T值，以获得ΔΔC_T值。
• 使用公式2^–ΔΔCT，来计算检测样品相对校验样本的靶基因表达水平的标准化数值。

内源性参比基因

为了对基因的表达进行相对定量检测，需要选取一个合适的基因做为对照。参比基因的表达水平应该在不同的实验条件或者相同组织和细胞系的不同状态下（比如，在疾病样本和正常样本中）维持恒定。对照RNA的表达水平应该与被研究的RNA大体一致。对照RNA经常用于相对定量检测–肌动蛋白、–2–微球蛋白、亲环蛋白A，GAPHD mRNA和18S rRNA等。广泛表达的–肌动蛋白mRNA，是最早被用做参比基因的RNA之一。但是，它的转录水平可能会改变，并且由于假基因的存在，导致在real-time PCR中会检测到基因组DNA，从而使得定量检测不准确。GAPDH是一种看家基因，经常被用做基因表达定量检测的参比基因。GAPDH的mRNA的表达水平可能在不同的个体，细胞周期的不同阶段以及不同药物处理之后有差别，这使得GAPDH在有些体系中不适合用做参比基因。由于18S rRNA不是mRNA，它的表达水平不能准确的反应细胞内mRNA的数量。因此组合各种基因才有可能给定量检测研究提供可靠的参照。

常用做内参基因的看家基因

* “+”转录本的相对丰度。

基因	人类基因符号	小鼠基因符号	人类的相对表达水平*	小鼠的相对表达水平*
18S ribosomal RNA	RRN18S	Rn18s	++++	++++
Actin, beta	ACTB	Actb	+++	+++
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	GAPDH	Gapdh	+++	+++
Phosphoglycerate kinase 1	PGK1	Pgk1	+++	+++
Peptidylprolyl isomerase A	PPIA	Ppia	+++	+++
Ribosomal protein L13a	RPL13A	Rpl13a	+++	+++
Ribosomal protein, large, P0	RPLP0	–	+++	–
Acidic ribosomal phosphoprotein PO	–	Arbp	–	+++
Beta-2-microglobulin	B2M	B2m	++ to +++	++ to +++
Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide	YWHAZ	Ywhaz	++ to +++	+
Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)	SDHA	Sdha	++	+
Transferrin receptor	TFRC	Tfrc	++	+
Aminolevulinate, delta-, synthase 1	ALAS1	Alas1	+	+
Glucuronidase, beta	GUSB	Gusb	+	+
Hydroxymethylbilane synthase	HMBS	Hmbs	+	++ to +++
Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1	HPRT1	Hrpt1	+	+
TATA box binding protein	TBP	Tbp	+	+
Tubulin, beta	TUBB	–	+	–
Tubulin, beta 4	–	Tubb4	–	+

PCR对照

无模板对照

无模板对照(NTC)可以检测PCR试剂是否被污染。一次NTC反应中包含了real-time PCR中除模板之外的所有成分。在NTC反应中检测到阳性信号说明存在核酸污染物。

阳性对照l

阳性对照很有必要，比如，在扩增一个新的目标序列时，它可用于确定引物集或者引物–探针集是否有效。阳性对照可以是绝对标准品（即明确知道核酸模板的拷贝数目），以提供定量检测的信息。从稳定细胞系中获得的核酸、包含克隆序列的质粒或者体外转录的RNA等绝对标准品，可以通过商业渠道获得或者在实验室中制备。阳性对照也可以是一个已知的阳性样本，通常用做绝对标准品的替代物，并且仅用于检测靶标存在与否。

无RT对照

在进行基因表达分析时，应该包含无RT对照实验。无RT对照实验是指，在做real-time PCR时不加入逆转录酶。对于病毒载量监测，根据样本的类型和该病毒物种的生命周期，无RT对照可能是必需的。由于无RT对照中，逆转录不可能发生，因此，无RT对照反应可以检测到DNA污染物，比如整合到宿主基因组中的病毒DNA序列。可以在RT-PCR之前，用脱氧核糖核酸酶处理样本，以除去RNA样本中的DNA杂质。

内质控

内在阳性对照可以检测到是否有PCR抑制剂存在。进行一次双重PCR反应，在这个反应中，目标序列使用一种引物–探针集扩增，而对照序列（即内部、阳性对照）用其他引物–探针集扩增。为了得到精确的检测结果，内在阳性对照应该使用足够多的拷贝数目。如果能检测到内在阳性对照的产物，但是却检测不到目标序列，则说明扩增反应是成功的，目标序列并不存在（或者拷贝数目太低，不能被检测到）。

有若干因素会导致假阴性结果，比如样本提取错误或者热循环仪故障。由于PCR或者RT-PCR被抑制导致实验失败是最常见的情况。

检测抑制子是否存在的最可行方法是使用内在阳性对照或内质控（IC）。内质控与待测病原体在同一离心管中同时纯化和扩增（或仅被扩增），并且应与外部阳性对照同时使用，以证明待测病原体扩增的反应混合液没有异常。内质控和外部阳性对照的结合使用可排除抑制子因素，确保得到的阴性结果是准确的。

内质控有多种类型，每种适用于不同应用。内源性内质控在待测样本中自然存在，例如宿主基因组中的一段序列（如β–actin）或是正常菌群基因组中的一段序列（如16s）。而外源性内质控是在核酸纯化时或进行PCR扩增之前加入样本中的。

外源性内质控可以是同源的，人工构建的模板，具有一段和待测病原体相同的引物核酸序列。尽管使用相同的引物，但待测病原体和内质控序列不同，因此可使用不同的探针区分病原体和内质控扩增子。而异源内质控是使用针对性的引物和探针检测的。

内源性和外源性同源内质控会竞争反应物，因此可能会影响检测待测病原体的灵敏度。例如，高起始浓度的内源性内质控模板会影响检测的灵敏度。起始浓度高可能是由特定样本类型或取样技术导致的。进行RNA相关研究时，可能是致病病原体过度导致的内质控的高表达。对于外源性同源内质控，因使用相同引物同时扩增待测病原体和内质控，导致二者竞争引物。此外，内源性内质控和同源内质控设计上具有冗余序列，所以仅适用于个别检测和应用。

至于操作安全性和工作流程简洁性，外源性异源内质控应用最灵活、可提供最多信息。内质控模板量是已知且统一的，并且其设计不受限制，可对各项属性进行优化。只有使用外源性异源内质控才可防止PCR反应物竞争，并且异源内质控可作为通用对照，便利的用于新检测。

内质控的特点

特点	外源性同源	外源性异源	内源性
通用于多种assays	否	是	否
作为纯化的对照	是	是	是
区分纯化错误和扩增错误	是	是	否
模板量已知且一致	是	是	否
非竞争性内质控设计	否	是	是

PCR类型

多重PCR

多重PCR在同一个反应中使用不同的引物对，以同时对多个目标序列进行扩增。这种类型的PCR通常需要充分优化退火条件，以便对不同的引物–模板系统实现最高效率的扩增。这种类型的PCR经常受到非特异性PCR产物的影响。严格的热启动程序和特别优化的缓冲溶液系统对于成功的多重PCR绝对是非常关键的。

与仅使用两个引物的标准PCR系统相比较，多重PCR所面对的另外一个挑战是，不同的引物对之间，杂交动力学性质不同。结合效率更高的引物能更充分的利用PCR反应试剂，从而导致其它PCR产物的减少。这通常会导致一些本应该被扩增的产物没有出现。有一些商业化的试剂盒经过特别的设计，可以避免这种情况，条件允许时，建议尽量使用这一类试剂盒。

长片段PCR

低于4 kb长的序列可以使用Taq DNA聚合酶和标准的PCR反应进行扩增。但是，扩增长度大于4 kb的序列，如果没有经过长度优化，通常会失败。失败的原因包括非特异性引物退火，DNA模板的二级结构，以及不理想的循环条件——所有这些因素对于长片段扩增的影响要远大于对短片段扩增的影响。防止DNA损伤，比如DNA脱嘌呤作用，对于长片段的扩增是非常重要的，这是因为模板DNA上的一个单独的损害就足以使PCR酶反应停顿。可以使用特别的缓冲试剂，稳定反应的pH值，以将DNA在PCR循环中所受到的损害将到最低。一些商业化PCR试剂盒经过特别的设计，比如，使用优化过的Taq DNA聚合酶和校正读码酶的混合物，从而可以克服长片段PCR所面对的问题。条件允许时，建议尽量使用这一类试剂盒。

单细胞PCR

单细胞PCR是一种使用有限的起始材料进行基因鉴定的有价值的工具。通过使用流式细胞术或者显微操作技术，能够根据细胞表面的标志物或者其物理形态，将感兴趣的单个细胞分离出来。低丰度模板分子扩增——有时候仅有一到两个基因拷贝——要求PCR系统具有非常高的效率、特异性和灵敏性。同样，市面上也有一些特别设计的针对单细胞PCR的商业化PCR试剂盒。

快速循环PCR

快速PCR扩增可以提高PCR的通量，使得研究者能将更多的时间用在下游的分析上。最新的快速PCR技术方面的发展缩短了得到结果所需要的时间。使用具有更高温度变化速率的热循环仪或者使用能显著缩短DNA变性、引物退火和DNA延伸所需的时间的新PCR试剂，以缩短循环时间，能够实现快速PCR。快速循环PCR试剂必须经过高度的优化，以保证扩增的特异性和灵敏性。

甲基化特异性PCR（MSP）

在MSP中，使用亚硫酸氢钠处理目标DNA，然后使用MSP确定其甲基化状态。这种方法需要设计两种引物集：一种引物集与未改变的胞嘧啶结合（即基因组DNA中甲基化的胞嘧啶），另外一种引物集与脲嘧啶结合，这些脲嘧啶是基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐处理转化形成的。与未改变的序列配对的引物所得到的扩增产物，说明其上的胞嘧啶是被甲基化了的，因此在用亚硫酸氢盐的处理时没有被改变。

必须使用严格的和高度特异性的PCR条件以避免非特异性引物结合以及人为的PCR扩增产物。由于将未甲基化的胞嘧啶转变成脲嘧啶降低了DNA的复杂性并且增强了引物–模板的非特异性结合，因此这一点非常重要。

热启动PCR

参见“热启动DNA聚合酶”了解更多的信息。

高保真PCR

参见“高保真DNA聚合酶”了解更多的信息。

RAPD：快速扩增多态性DNA分析

RAPD是一种基于PCR的，分子水平生物体研究工具。这种方法使用小的，非特异性引物扩增基因组DNA上看似随机的区域。在使用琼脂糖凝胶电泳分析时，成功的引物对在不同的个体，菌种和物种上所得到的PCR产物，显示不同的条带模式。

在RAPD实验中，引物的长度仅有10个碱基左右。因此，退火温度需要低于40°C。

RACE：cDNA末端的快速扩增

RACE是RT-PCR技术的一个变体，用来扩增mRNA模板的一个内部位点与其3’或5’末端之间的未知序列。RACE仅需要知道目标mRNA上的一段短的序列。这种技术通常用来克隆不完整的cDNA分子的剩余部分。有两种RACE技术：

• 5' RACE——扩增cDNA的5'末端
• 3' RACE ——扩增cDNA的3'末端

两种RACE技术的第一步一样，都是使用逆转录酶将RNA转化成单链的cDNA。区别在于第二步不同，两种技术所得到的信息可以用来得到完整的cDNA序列。

由于RACE使用mRNA中的一个锚定位点作为参考位点，它有时候也被称作“锚定PCR”。

原位PCR

原位PCR技术是在玻片上的细胞内部进行的PCR反应，这种技术综合了PCR或者RT-PCR扩增的灵敏性与原位杂交技术。原位PCR技术能确定细胞的标志物并进一步定位细胞群中（比如组织或者血液样本中）的细胞特异性序列。因此，原位PCR是研究疾病进展的强有力的工具。

在这种技术中，新鲜的和固定的细胞和组织样本都能用，但是样本制备对结果非常关键，并且细胞的固定对PCR信号有直接的影响。这种技术适合使用放射性标记的，荧光标记的或者生物素标记的核酸探针。

PCR的过程本质上与标准的PCR过程相同，但是需要修改一些反应条件（比如Mg²⁺浓度）。

差异显示PCR

差异显示PCR是一种基于RT-PCR的技术，用来比较并确定两个细胞系或者细胞群中mRNA（也就是基因）的表达模式的差异。

在这种技术中，通过使用与mRNA的poly(A)尾处的13个核苷酸以及转录序列上与之相邻的两个核苷酸互补的引物，引导第一条cDNA链合成。经过逆转录和序列扩增之后，使用凝胶电泳观测扩增产物。通过比较两个细胞群的不同条带模式，确定其所表达的cDNA的差异。

这种技术发明于20世纪90年代，并迅速成为基因表达分析领域的关键技术。但是最近这种技术更多的被RNA-seq、微阵列技术和qRT-PCR技术所取代。

RT-PCR准则

在进行real-time RT-PCR时，必须仔细的选择逆转录的酶和引物。引物要能逆转录所有感兴趣的并且，并且逆转录酶所得到的cDNA的量必须能精确的反映原始RNA量，以便能精确定量检测。除此之外，逆转录反应的成分对于后续的real-time PCR反应的影响要达到最小。

为以RNA为起始模板进行PCR反应，必须通过逆转录反应(RT)将RNA逆转录成cDNA。RT和PCR可以在同一个试管中相继完成（一步法RT-PCR），也可以分开完成（两步法RT-PCR）。一步法RT-PCR需要基因特异性的引物。

Real-time RT-PCR可以通过一步法或者两步法完成。在两步法PCR中，首先使用寡聚dT引物、随机的寡聚物，或者基因特异性的引物，将RNA逆转录成cDNA。将逆转录反应产物分成若干等分，加入到real-time PCR反应中。可以根据实验的需要，选择不同类型的RT引物。使用寡聚dT引物或者随机的寡聚物进行逆转录反应，意味着可以通过一个逆转录反应的产物，对几个不同的转录本进行PCR扩增和分析。除此之外，珍贵的RNA样本可以立刻转录成更加稳定的cDNA，以用于后续的实验或者长期储存。

在一步法RT–PC反应中——也被称为单管RT-PCR反应——逆转录和real-time PCR在同一个试管中进行，逆转录反应先于PCR反应。特别的反应试剂和循环方案使之成为可能。快速的流程可以迅速的处理多个样本，并且易于实现自动化。操作步骤的减少提高了不同样本结果的可重复性，并且由于减少了操作，降低了样本被污染的风险。

不同的RT-PCR操作流程的优势

操作	优势
两步法RT-PCR	多重PCR进行一个RT反应 RT引物选择灵活 可长期储存cDNA
一步法RT-PCR	操作简便 流程快速 可重复性高 污染可能性小

RT引物的选择

逆转录反应选取什么样的引物取，决于进行的是一步法还是两步法RT-PCR。在一步法RT-PCR中，下游PCR反应的引物即为逆转录的引物。因此，一步法RT-PCR一定要使用基因特异性引物。在两步法RT-PCR中，可以使用三种不同类型的引物以及它们的混合物，它们分别是寡聚dT引物（通常包含13–18个核苷酸），随机的寡聚物（比如六聚物，八聚物或者九聚物），或者基因特异性的引物。如果使用寡聚dT引物，仅mRNA能从其3'末端的poly–A的尾巴处逆转录。随机的寡聚物能够逆转录所有的RNA，包括核糖体RNA，转运RNA，和核内小分子RNA。由于逆转录是从RNA分子中间的某些位点上开始的，因此，这将得到相对较短的cDNA分子。而基因特异性的引物可以逆转录某一特定转录本。

两步法real-time RT-PCR中的逆转录反应中，采用通用引物应该就能高灵敏度、可重复的扩增和检测任何PCR产物，不受长度和扩增子的位置限制。

RT-PCR应用中引物类型的适用性

应用	推荐的引物类型
特定转录本的RT-PCR	基因特异性的引物具有最高的灵敏性，并且只逆转录所选定的RNA分子
长扩增子的RT-PCR	寡聚dT引物或者基因特异性引物
长转录本中的扩增子的RT-PCR	推荐基因特异性引物，随机的寡聚物，或者寡聚dT引物和随机九聚体的混合物，这样可以得到覆盖完整转录本的cDNA

两步法RT-PCR的条件

加入到两步法RT-PCR中的RT反应溶液的体积的影响

在两步法RT-PCR中，加入到后续的扩增反应中的逆转录反应溶液中的，不仅包含了cDNA，还包含了盐、dNTP和逆转录酶。逆转录反应的缓冲液，与real-time PCR缓冲液的盐成分不同，因此会损害real-time PCR的效果。但是，如果RT反应溶液的体积占最终的real-time PCR体积的10%或者更少，这种损害就不那么明显。如果20 µl的PCR反应溶液中包含了3 µl的RT反应溶液（即总体积的15%），那么real-time PCR反应就会被显著抑制。我们建议测试下逐渐稀释的RT反应溶液对real-time PCR反应的影响，以确定这种影响的线性关系。这可以帮助消除RT反应混合物对PCR的抑制作用，以免影响对转录本的精确定量检测。

RNA二级结构的影响

RNA的二级结构能从几个不同的方面影响RT-PCR。具有复杂结构的RNA区域会终止逆转录酶的作用或者使其从RNA模板上解离出来。

截断的cDNA片段由于缺失下游的引物结合位点，不能被PCR反应所扩增。而逆转录酶可能跳过RNA的环状区域，这样，在合成的cDNA中就不包含这段序列。在PCR反应中，这些缺失中间序列的cDNA被扩增，并产生了缩短的PCR产物。理想状况下，逆转录酶应该不受RNA二级结构的影响，并且能够逆转录任何模板，而不需要反应优化。

如果序列中的GC含量较高，那么RNA：DNA所形成的杂交物会结合的非常紧密，并且会影响PCR反应中的引物结合，阻止DNA聚合酶的作用。RNase H可以去除RNA：DNA杂交物中的RNA，方便引物结合和第二条DNA链合成。以前的研究显示，RNase H能够改善RT-PCR的产量，并且对于扩增某些序列是必须的——即使是157 bp的短序列（7）。

一步法RT-PCR的条件

一步法RT-PCR中理想的逆转录酶，应该与前述两步法RT-PCR中的逆转录酶有相同的性质。但是一步法RT-PCR中的一个主要问题是，逆转录酶对于PCR反应的抑制作用。这会导致C_T值增大，从而使得其灵敏性和特异性不如两步法RT-PCR。

RT-PCR引物设计

RT-PCR中的一个关键因素是，选择合适的引物以达到最高的效率和最大的特异性。引物的特异性受到很多因素的影响，包括序列、引物的位置和使用的RT-PCR体系。常规PCR实验的引物设计规则也适用于RT-PCR，可避免错误引导或者引物二聚体的形成。这些设计规则在RT-PCR中可能更加重要，这是由于逆转录得到的cDNA是单链，更容易与引物非特异性结合。RT-PCR反应中，引物非特异性的结合会降低反应的灵敏度，导致特定产物减少，甚至整个RT-PCR反应失败。

为了避免扩增基因组DNA，可以这样设计RT-PCR的引物：引物的一端与一个外显子的3’端杂交，另一端与相邻外显子的5’端杂交。这样的引物在退火时，与剪接后的mRNA逆转录得到的cDNA杂交，而不与基因组DNA杂交。

为了测定DNA污染物是否被扩增了，在设计RT-PCR的引物时，应使其覆盖的区域包含至少一个内含子。从cDNA（不包含内含子）扩增得到的产物，比从基因组DNA（包含内含子）扩增得到的产物要短。产物尺寸上的差别可以检测DNA污染物是否存在。

如果仅mRNA序列已知，请选择相隔至少300–400 bp核的引物退火位点。因为真核DNA上，这种尺度的片段可能包含剪接位点。如前所述，这样的引物可以用来检测DNA污染物存在与否。

总的说来，在设计RT-PCR的引物时，需要考虑如下因素：

• 退火温度会影响RT-PCR的效率和灵敏性。
• 高引物浓度会导致错误引导和引物二聚体的形成。
• 严格的热启动流程对于得到最佳的RT-PCR结果的必备条件。
• RT-PCR引物设计应使其能够区别出RNA和DNA污染物的信号。为了得到最好的结果，应该使用不含DNA的RNA以避免RT-PCR反应中DNA参与竞争。

RT-PCR中使用的酶

RT-PCR将逆转录和PCR联合起来，以分析RNA。使用逆转录酶以RNA为模板合成cDNA——RNA依赖的DNA聚合酶，通常从多种逆转录病毒中提取出来（比如禽类成髓细胞瘤病毒 [AMV]或者莫洛尼鼠类白血病病毒 [MMLV] ）。

尽管热力学稳定的DNA聚合酶，比如Tth DNA聚合酶，在特定的条件下也具有逆转录酶的活性，但是这些酶不如中温逆转录酶高效。

在较低温度下，逆转录反应生成的单链cDNA比双链DNA（基因组DNA）更容易与引物非特异性的结合。非特异性的退火会导致扩增的特异性较差，特别是在有限的cDNA的数量和低丰度的转录本的情况下，会降低反应的灵敏性和可重复性。扩增的特异性对于成功的RT-PCR是至关重要的，这可以通过同时使用包含特别修饰过的逆转录酶的新型的缓冲溶液和热启动PCR实现。

多重PCR和RT-PCR

在多重real-time PCR中，可以在同一个反应中同时定量检测几个基因组靶标DNA。多重real-time RT-PCR是一组类似的方法，用于在同一组反应中同时定量检测几个不同的RNA靶标。具体操作时，既可以采用两步法RT-PCR，也可以采用一步法RT-PCR。

多重PCR和RT-PCR在很多应用中有巨大的优势，比如基因表达分析，病毒载量检测和基因分型检测。目标基因和内质控在同一个反应中被同时扩增，以避免单独扩增时各个反应小孔之间的差异。内质控可以是不同的样本中，没有表达差异的内源性基因（比如看家基因），也可以是外部的核苷酸序列。对于病毒载量检测而言，使用外源性的核酸作为内质控，可以检测样本的准备是否成功，抑制剂存在与否以及PCR是否成功。多重分析可以非常高的精度对基因进行相对定量检测，其中目标基因的数量根据对照组的参比基因的数量进行标准化。在一个反应中，对多个基因定量检测减少了试剂的使用，节省了珍贵的样本材料，并且提高了通量。

可以用光谱相距较远的荧光染料和适当的淬灭基团标记基因特异性探针，此类探针使得多重PCR和RT-PCR成为可能。这意味着染料的最大发射波长必须被明确分离，并且彼此之间不能重叠。除此之外，反应必须在支持多重分析的，适当的real-time扩增仪中进行（即在同一个小孔或者试管中激发并检测几种不重叠的染料）。

全转录组扩增(WTA)

全转录组扩增(WTA)可采用非常少量的RNA，对整个转录本进行扩增，从而可以用real-time RT-PCR技术对转录本进行无限制的分析。RNA样本的全转录本扩增首先使用逆转录反应生成cDNA，并将cDNA连接，最终使用多重置换扩增技术(MDA)进行扩增。

当仅有ng级的RNA样本时，所能进行的real-time RT-PCR分析的数目是非常有限的。这一问题可通过WTA解决。这种技术中，一个RNA样本中所有的mRNA转录本都被复制了，以得到mg级别的cDNA模板。这些cDNA足够进行不受限制的real-time PCR分析，并得到稳定的结果。

WTA技术

为了得到可靠的real-time PCR 结果，WTA方法需要能够无偏且准确的扩增整个转录本。这意味着每一个转录本的序列和相对丰度在WTA实验中都保留下来，否则基因表达分析会得到错误的结果。

逆转录反应使用了随机的寡聚物和寡聚dT作为引物，构建了覆盖所有转录序列（包括3’端和5’端）的cDNA文库。将这些cDNA连接起来，并且使用MDA技术，通过独特的进行性DNA聚合酶得到扩增后的cDNA。这些cDNA保留了初始RNA样本中的转录本呈递信息。这对于精确的基因表达分析非常重要。

在进行WTA实验时，同时考虑起始材料量（即细胞的数量或者RNA的数量）和感兴趣转录本的拷贝数目是非常重要的。表“不同细胞数量的转录本”显示了起始材料量与转录本呈递之间的关系（注意这仅作为指导：每一定量检测的起始材料的转录本数量可能会变化）。如果起始材料中，转录本的拷贝数目低于10（在表中用粗体显示），可能会发生随机性的问题（即非常低数量的转录本在高度稀释的溶液中的不均匀分布）。这可能会在WTA的开始阶段，导致低拷贝转录本的数量被低估。对于嵌合转录本应该特别考虑。嵌合转录本是由仅在组织的一部分细胞中表达的基因转录而成的。由于这些转录本不是在每一个细胞中都存在，因此在较低的起始材料量的情况下（比如1–10²个细胞），它们不能被精确测定。

可靠的WTA取决于转录本的拷贝数目。10 ng的DNA相当于500个细胞，在这种情况下，即使低拷贝数目的转录本也能被准确的测定。使用更少的RNA或者非常有限数目的细胞，意味着起始材料中可能会缺失低拷贝转录本，或者仅包含部分低拷贝转录本。

不同细胞数量的转录本

*含有各种转录本。
^†随机的mosaic转录本。
^‡随机的低拷贝和mosaic转录本。 
^§随机的低拷贝转录本，mosaic转录本有丢失。

参数	103个细胞*	103个细胞†	10个细胞‡	1个细胞§
RNA量 (ng)	20	2	0.2	0.02
高拷贝转录本的数量	107	106	105	104
中等拷贝转录本的数量	105	104	103	102
低拷贝转录本的数量	103	102	10	1
mosaics转录本的数量	102	10	1	0

DNA污染

去除DNA污染

如果PCR的引物也能扩增基因组DNA序列，RNA样本中痕量基因组DNA的污染会干扰real-time RT-PCR的定量检测。为了避免基因组DNA污染的负面影响，需要仔细的设计引物。如果这不能实现，应该使用DNase I处理RNA样本，以降解掉DNA污染物。

检测RT-PCR中的DNA污染

使用合适的对照可以检测到RT-PCR中的任何DNA污染物。应分别在逆转录酶存在和不存在的情况下进行反应。如果在不存在逆转录酶的情况下出现了产物，则说明样本中存在DNA污染物。

参考文献

Bustin, S.A., ed. (2004) A-Z of Quantitative PCR. La Jolla, CA: International University Line.

引用文献

1. Ausubel, F.M., et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.
2. Pavlov, A.R. et al. (2004) Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient amplifications. Trends in Biotechnology 22, 253.
3. Thellin, O. et al. (1999). Housekeeping genes as internal standards: use and limits. J. Biotechnol. 75, 291.
4. Vandesompele, J., et al. (2002) Genome Biol. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. 3, RESEARCH0034.
5. Pfaffl, M.W., Horgan, G.W., and Dempfle, L. (2002) Relative expression software tool (REST^©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res. 30, e36.
6. Derks, S. et al. (2004) Methylation-specific PCR unraveled. Cell Oncol. 26, 291.
7. Tacke, E. et al (1995) Transposon tagging of the maize Glossy2 locus with the transposable element En/Spm. Plant J. 8, 907.