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使用Co-IP方法验证蛋白质相互作用的解决方案

2018-08-29文章来源：Takarabiomed

使用Co-IP方法验证蛋白质相互作用的解决方案

在酵母杂交实验中，由于文库的构建是通过cDNA片段链接到质粒上的，所以有时会产生2/3移码突变或者编码蛋白质提前终止的假阳性情况。因此，在研究蛋白质互作过程中，酵母杂交筛选出相关蛋白质后，还需用其他方法进行验证，看看目的蛋白质和筛选出的文库蛋白质是不是“真爱”。免疫共沉淀法（Co-IP），是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。传统的Co-IP方法是用预先固化在琼脂糖珠上的protein A的抗体免疫沉淀A蛋白质，那么与A蛋白质在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来，以此来验证筛选出的蛋白质是否具有相互作用。这一次我们将介绍一种突破性的免疫共沉淀Kit——635721 Capturem^™ IP&Co-IP,采用特殊工艺将protein A固定在新型Capturem^™ 膜上，从而大幅度缩短实验时间，并提高纯化效果。

接下来我们看一下完成酵母杂交蛋白质筛选实验后，该如何采用Co-IP方法进行验证。这里我们可以引入标签蛋白质myc或者HA，利用标签抗体来进行Co-IP实验。这两种标签蛋白质具有良好表征和高免疫反应性，同时也很容易通过Western Blotting实验进行检测。此外，由于Myc和HA是小标签，所以通常不会影响目的蛋白质的功能。

关于如何引入myc或者HA标签，实际上是非常简单的。首先我们来看一下Clontech Matchmaker酵母双杂交系统中的BD载体和AD载体：

这两种载体在bait序列和文库序列的插入位点前面，分别有两个蛋白质标签基因：c-myc和HA。这样，我们就可以通过PCR的方法，合并目的蛋白质和抗原标签蛋白质序列：

将Bait-c-Myc与Library-HA构建到合适的载体上，这里可以选择Clontech 631604 pCMV-Myc & pCMV-HA Vector Set这款载体套装。这款载体套装可以使哺乳动物细胞表达标签融合蛋白质，同时还提供了myc和HA标签蛋白质抗体，方便于后续Co-IP实验和WB实验。Bait-c-Myc与Library-HA克隆到对应载体上后，将载体转染到哺乳动物细胞表达，之后就可以进行Co-IP实验了。

关于Co-IP实验部分，我们强烈推荐Capturem^™ IP&Co-IP的方法，我们可以将它与传统的protein A琼脂糖珠方法进行比较。首先来看传统的protein A琼脂糖珠的方法：

整个流程需要接近16-18 h。也就是说，仅仅是Co-IP纯化的实验就要消耗1天的实验时间。而使用我们的新方法Capturem^™ IP&Co-IP，采用特殊工艺将protein A固定在新型Capturem^™ 膜上，利用抗体和protein A可以结合在一起的特点，从而实现抗体-互作蛋白质复合物的纯化。我们来看一下具体操作流程：

我们从流程图中可以看到，抗体和蛋白质裂解液孵育需要10 min，每个柱子最多可加入800 μl包含抗原抗体复合物的样品，然后用100 μl wash buffer洗涤， 30-50 μl elution buffer洗脱。每个步骤之间仅需1,000×g离心1 min，样品与抗体孵育后，从上样到洗脱纯化，仅需5 min，宛如魔法一般神奇！由于样品在Capturem^™膜上停留的时间短，所以可以很大程度的避免了复合物的凝集、解体或失活，从而提高纯化实验的成功率。

上面的Co-IP实验是基于哺乳动物细胞表达融合蛋白质完成的，如果是植物蛋白质做Co-IP，就需要用到另一种方案：

可以说，Co-IP部分的实验流程和前面是一样的，区别在于植物蛋白质的Co-IP需要用植物蛋白质表达载体（可以选择使用Takara Code No. 3261 pRI 910 DNA）表达标签融合蛋白质。由于植物基因的导入过程相对来讲稍微繁琐，需要用到农杆菌转化法将重组质粒在烟草或者拟南芥等模式植物中进行表达。

以上就是Co-IP方法对互作蛋白质进行验证的实验方法，如果有诱饵或捕获蛋白质的抗体，那就可以直接用Capturem^™ IP&Co-IP中的细胞裂解液裂解细胞，之后与抗体孵育，再对抗体-互作蛋白质复合物进行纯化；如果没有对应的抗体，则需要引入标签蛋白质，利用标签蛋白质抗体完成Co-IP的实验。

“确认过眼神，我遇上对的Kit。”使用Capturem^™ IP&Co-IP将大量解放您的实验时间，提高您的实验效果，为您的实验提供更多的选择！