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一步法RT-qPCR快速筛查新冠病毒
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多人死亡，往返中国的航班取消，潜在接触者被隔离，促使世界卫生组织（WHO）宣布新型冠状病毒（2019-nCoV）疫情被划入“国际关注的突发公共卫生事件”（PHEIC）。截至2020年2月10日，2019-nCoV引发的呼吸道疾病已导致全球1000余人死亡，4万余人确诊患病。
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冠状病毒是一类能引起上呼吸道和下呼吸道疾病的病毒，具有类似太阳冠冕的特征性尖刺外观。许多常见的冠状病毒通常会导致轻度到中度的症状，但有些病毒会导致严重的症状，并可能发展为致命的肺炎，比如在2003年爆发的SARS-CoV 和2015年的MERS-CoV。由于2019-nCoV引发的肺炎导致多人死亡，且可能潜在的无症状个体传播，因此，对该病毒进行有效的实验室筛查对控制此次疫情至关重要。
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2020年1月24日，中国疾病预防控制中心等权威机构发布了鉴定2019-nCoV的文献《A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019》。文章中，作者开发了一种病毒筛选方法，通过RNA-Seq技术获得了特异性病毒序列，对2019-nCoV进行测序和分类，还使用光镜和透射电镜观察了2019-nCoV感染的人呼吸道上皮细胞中培养物的病毒颗粒和细胞病变效应。这其中使用了Takara探针法One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Code No. RR064）。
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中国科学院武汉病毒研究所发表的文章《Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin》，已经鉴定出该病毒在整个基因组水平上与蝙蝠冠状病毒96%相同，对7种保守的非结构蛋白的成对序列分析表明，该病毒属于SARSr-CoV。重要的是，他们证实2019-nCoV使用了与SARS冠状病毒相同的细胞进入受体ACE2。该团队使用了Takara的SMARTer RACE 5'/3' Kit（Code No. 634858） 用于确定病毒基因组的5'末端序列。
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另一个研究小组（Letko和Munster 2020）利用Takara高效率无缝克隆技术In-Fusion HD Cloning Kit（Code No. 639648）克隆了该病毒的刺突编码序列，研究了2019-nCoV的细胞进入机制。
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类似的方法已经被许多组织用来识别这种特殊病毒的其他部分。中国疾病预防控制中心推荐了One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Code No. RR064）用于2019-nCoV的检测，并已经在中国各地被广泛使用。世界卫生组织（WHO）和疾病预防控制中心（CDC）已经开发出类似的方法，随着更多病例的报道，WHO将对病毒检测方法提出更多建议。
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我们正迅速行动，以满足中国以及其他国家不断增加的2019-nCoV筛查需求。
Takara 愿以高质量的产品和热忱的服务，为2019-nCoV筛查贡献绵薄之力。
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山川异域，风月同天。守望相助，众志成城。
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Takara提供2019-nCoV筛查完整解决方案
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产品
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Code No.
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包装量
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用途
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DNA-OFF™
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9036
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500 ml
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去除实验区域DNA污染
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RNase-OFF™
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9037
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500 ml
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去除RNase污染
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TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0
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9766
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50 次
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柱式法病毒核酸提取
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RNAiso Plus
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9108/9109
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100/200 ml
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试剂型Total RNA提取
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One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
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RR064A/B
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100/500 次 （50 μl反应）
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probe法One Step RT-qPCR
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PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix
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RR650A/B
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200/1,000 次（25 μl反应）
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无需RNA纯化，直接进行probe法One Step RT-qPCR
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PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix, with UNG
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RR651A/B
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200/1,000 次（25 μl反应）
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RR650的UNG版本，防止假阳性
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One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix
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RR600A/B
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200/1,000 次（25 μl反应）
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完全premix型probe法One Step RT-qPCR
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One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix, with UNG
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RR601A/B
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200/1,000 次（25 μl反应）
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RR600的UNG版本，防止假阳性
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Uracil DNA Glycosylase (UNG), heat-labile
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2820
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200 U
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防止Carryover污染导致的假阳性
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dU plus dNTP Mixture (12.5×)
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4035
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800 μl
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防止Carryover污染导致的假阳性
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dNTP Mixture
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4030
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各3.2 μmol/1.28 ml
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PCR底物
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dNTP Mixture
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4019
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各2.5 μmol/250 μl
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PCR底物
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Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)
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2641A/B
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10,000/40,000 U
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反转录酶
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Recombinant RNase Inhibitor
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2313A/B
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5,000/25,000 U
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RNase抑制剂
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T7 RNA Polymerase
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2540A/B
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5,000 U/25,000 U
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RNA标准品的体外转录
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RNase-free Water
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9012
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1 ml×10 支
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RNA实验用水
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除上述目录产品外，Takara不断完善病毒检测方案，提供WHO、中国疾病预防控制中心公布指导的引物探针套装、美国疾病控制与预防中心公布指导的引物探针套装。
同时，引物探针套装中还增加了所有检测靶点Control RNA产品。
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一、新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因、E蛋白基因、N蛋白基因检测套装：
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序号
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Primer/Probe名称*
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碱基序列 (方向为5' to 3')*
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5'修饰
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3'修饰
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Control RNA**
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01
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2019-nCoV RdRP_SARSr-F2
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GTG ARA TGG TCA TGT GTG GCG G
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Ger-RdRP
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02
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2019-nCoV RdRP_SARSr-R1
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CAR ATG TTA AAS ACA CTA TTA GCA TA
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03
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2019-nCoV RdRP_SARSr-P2
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CAG GTG GAA CCT CAT CAG GAG ATG C
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FAM
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BHQ-1
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04
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2019-nCoV RdRP_SARSr-P1
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CCA GGT GGW ACR TCA TCM GGT GAT GC
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FAM
|
BHQ-1
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05
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2019-nCoV E_Sardeco-F1
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ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT
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Ger-E
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06
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2019-nCoV E_Sardeco-R2
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ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A
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07
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2019-nCoV E_Sardeco-P1
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ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG
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FAM
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BHQ-1
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08
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2019-nCoV N_Sarbeco_F1
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CAC ATT GGC ACC CGC AAT C
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Ger-N
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09
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2019-nCoV N_Sarbeco_R1
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GAG GAA CGA GAA GAG GCT TG
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10
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2019-nCoV N_Sarbeco_P1
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ACT TCC TCA AGG AAC AAC ATT GCC A
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FAM
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BHQ-1
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二、新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N基因检测套装：
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序号
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Primer/Probe名称*
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碱基序列 (方向为5' to 3')*
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5'修饰
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3'修饰
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Control RNA**
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11
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2019-nCoV nsp14F
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TGG GGY TTT ACR GGT AAC CT
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HK-ab1
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12
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2019-nCoV nsp14R
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AAC RCG CTT AAC AAA GCA CTC
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13
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2019-nCoV nsp14P
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TAG TTG TGA TGC WAT CAT GAC TAG
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FAM
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TAMRA
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14
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2019-nCoV NF
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TAA TCA GAC AAG GAA CTG ATT A
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HK-N
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15
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2019-nCoV NR
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CGA AGG TGT GAC TTC CAT G
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16
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2019-nCoV NP
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GCA AAT TGT GCA ATT TGC GG
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FAM
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TAMRA
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根据中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所公布指导，Takara提供一个qPCR引物探针套装：
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序号
|
Primer/Probe名称*
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碱基序列 (方向为5' to 3')*
|
5'修饰
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3'修饰
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Control RNA**
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17
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CDC 2019-nCoV ORF1ab-F
|
CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
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CDC-ORF1ab
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18
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CDC 2019-nCoV ORF1ab-R
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ACGATTGTGCATCAGCTGA
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19
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CDC 2019-nCoV ORF1ab-P
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CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG
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FAM
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BHQ-1
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20
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CDC 2019-nCoV N-F
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GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
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CDC-N
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21
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CDC 2019-nCoV N-R
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CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
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22
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CDC 2019-nCoV N-P
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TTGCTGCTGCTTGACAGATT
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FAM
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TAMRA
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根据美国疾病控制与预防中心公布指导，Takara提供一个qPCR引物探针套装：
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序号
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Primer/Probe名称*
|
碱基序列 (方向为5' to 3')*
|
5'修饰
|
3'修饰
|
Control RNA**
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23
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US CDC 2019-nCoV_N1-F
|
GACCCCAAAATCAGCGAAAT
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US-N1
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24
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US CDC 2019-nCoV_N1-R
|
TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
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25
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US CDC 2019-nCoV_N1-P
|
ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC
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FAM
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BHQ-1
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26
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US CDC 2019-nCoV_N2-F
|
TTACAAACATTGGCCGCAAA
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|
US-N2
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27
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US CDC 2019-nCoV_N2-R
|
GCGCGACATTCCGAAGAA
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28
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US CDC 2019-nCoV_N2-P
|
ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG
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FAM
|
BHQ-1
|
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29
|
US CDC 2019-nCoV_N3-F
|
GGGAGCCTTGAATACACCAAAA
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US-N3
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30
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US CDC 2019-nCoV_N3-R
|
TGTAGCACGATTGCAGCATTG
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31
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US CDC 2019-nCoV_N3-P
|
AYCACATTGGCACCCGCAATCCTG
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FAM
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BHQ-1
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32
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US CDC RP-F（内参检测用）
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AGATTTGGACCTGCGAGCG
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33
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US CDC RP-R（内参检测用）
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GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
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34
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US CDC RP-P（内参检测用）
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TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
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FAM
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BHQ-1
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*所有引物探针为HPLC纯化级别，客户可以根据需要选择合适的套装。
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**Control RNA产品需单独订购，订购时请咨询各地代理商。
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Takara还可以提供使用简便、性价比高、可靠的Real Time PCR仪Thermal Cycler Dice Real Time System III (Code No. TP950)。 除具有以往Takara PCR仪受到好评的友好操作软件外，还搭载触摸屏控制面板，可进行单机 (独立) 操作，以追求操作简便性。
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特点介绍：
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◇ 搭载触摸屏，可独立操作，支持英语/日语界面，仪器软件更加追求操作简便性。
◇ 可做高速定量PCR反应。
使用嵌合荧光染料检测法时，与试剂TB Green Fast qPCR Mix（Code No. RR430）搭配使用，TP950可完成快速定量PCR反应。
◇ 专为科研用户设计的便于操作的定量软件。
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