RNA scope实验方法（参考ACD说明书官网）

实验原理：

RNAscope®是一项新颖的用于检测位于完整细胞中目标RNA的原位杂交（In Situ Hybridization，ISH)检测技术。该技术以其能放大特异性信号而非噪音信号的专利探针设计方法。RNA原位杂交是基于反义RNA与靶基因RNA的碱基配对原理，利用地高辛标记的反义RNA为探针，与切片杂交，从而原位显示RNA的表达部位和相对丰度。RNA原位杂交是研究基因表达谱的重要方法。

RNAscope®独特的双Z (ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。双Z探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。

实验步骤（冰冻组织切片样本）：

1. 组织切片前，在 –20° C 平衡组织块，时长为至少 1 小时。

2. 用冰冻切片机将包埋好的组织切成 7-15µm（15μm） 的切片。将切片粘附在 SUPERFROST ® Plus 载玻片上。为获得最佳染色，按如图所示放置组织：

3. 在 –20° C 下放置 20 分钟干燥切片。如果不立即使用该切片，则在 -80℃保存。

4. 载玻片置于 Tissue-Tek ® 载玻片架，用 200mL 1× PBS 中清洗载玻片 5 分钟，上下移动载玻片架以清洗去除 OCT。

准备预处理所需材料和仪器

1. 打开 HybEZ™ 杂交炉，将温度设置为 40° C。

2. 将一张吸水纸放入湿盒内中 (50 ml)，并用蒸馏水将其彻底浸湿。

3. 盖上盖，将湿盒放入杂交炉，关闭炉门。在 40° C 下预热 30 分钟。

4. 向烧杯中倒入 1 瓶（70mL）10× 靶标修复试剂，然后加入 630mL 蒸馏水，混合制备得到 700mL RNAscope ® 1× 靶标修复试剂。用锡箔纸覆盖烧杯，将烧杯放在热板上。将加热板调至高档，加热 10-15分钟 (15分钟) 至 1× 靶标修复试剂达到缓慢沸腾状态（98-102℃）后，将热板调至低档，以维持缓慢沸腾状态。使用前煮沸不超过 30 分钟。

RNAscope ® 双氧水处理

RNAscope ® 靶标修复试剂处理画疏水圈

1. 将载玻片放置在 HybEZ™ 载玻片架上，滴加约 5-8 滴 RNAscope ®双氧水，使其覆盖样本。

2. 室温下孵育载玻片 10 分钟。

3. 在吸水纸上轻敲和 / 或轻弹载玻片，去除载玻片上的 RNAscope ® 双氧水，立即将载玻片插入浸没于装满蒸馏水的 Tissue-Tek ® 清洗皿中的 Tissue-Tek ® 载玻片架上。

4. 上下移动 Tissue-Tek ® 载玻片架，清洗载玻片 3-5 次（3次/3 分钟）。

双氧水处理的目的，一种强氧化剂，通透细胞的作用，使细胞的RNA充分暴露出来。

RNAscope ® 靶标修复试剂处理

1. 用镊子将 Tissue-Tek ® 载玻片架 非常缓慢 地浸没在 1× 靶标修复试剂中，5 分钟。

2. 用镊子立即将热载玻片架从 1× 靶标修复试剂中转移至盛有蒸馏水的染色皿中。请勿在 1× 靶标修复试剂中冷却载玻片。

3. 上下移动 Tissue-Tek ® 载玻片架，清洗载玻片 3次/5分钟。

4. 将载玻片转移至 100% 乙醇，孵育 3 分钟。

5. 室温下完全干燥载玻片。

画疏水圈

1. 使用 Immedge™ 疏水笔按照以下模板在每张切片周围画疏水圈 2-4 次。

重要！不要让疏水圈接触组织切片。强烈推荐使用 Immedge™ 疏水笔。其它疏水笔可能无法达到最理想的效果。

RNAscope ® 蛋白酶 III 处理

1. 将载玻片置于 EZ-Batch™ 载玻片夹上，滴加约 5 滴 RNAscope ®蛋白酶 III 试剂，以完全覆盖切片。

2. 从 HybEZ™ 杂交炉中取出 HybEZ ™ 湿盒，将载玻片夹放入盒中。盖上盖，将放入杂交炉，40摄氏度， 30分钟。

4. 从杂交炉取出 HybEZ™ 湿盒。从盒中取出 EZ-Batch ™ 载玻片夹。

5. 立即将 EZ-Batch™ 载玻片夹放入盛有蒸馏水的 EZ-Batch ™ 清洗槽中。不时地晃动 EZ-Batch ™ 清洗槽，清洗载玻片 3-5 次。

6. 使用新鲜的蒸馏水重复步骤 5。

RNAscope ® 多通道二代荧光检测

准备材料

制备 1× 清洗缓冲液

1. 将 RNAscope ® 50× 清洗缓冲液在 40° C 下预热 10-20 分钟。

2. 将 5.88 L 蒸馏水和 2 瓶（120 mL） RNAscope ® 清洗缓冲液（50×）加入大玻璃瓶中，充分混合，配制成 6 L 的 1× 清洗缓冲液。

准备探针

1. 在水浴箱或孵育箱中，40° C 预热探针至少 10 分钟，然后冷却至室温（RT）。

2. 快速离心将 C2 和 C3 探针液体收集在探针管底部。

3. 根据用量需求，取 1 体积 C2 、1 体积 C3 探针和 50 体积 C1 探针混合备用。

平衡试剂

1. 从冰箱中取出 AMP 1、AMP2、AMP3、 HRP-C1、HRP-C2、HRP-C3 和 HRP 阻断剂，置于室温下。

2. 确保 HybEZ™ 杂交炉和湿盒维持 40° C。

3. 150 mL 蒸馏水加 50 mL 20X SSC，充分混合，制备得到 200 mL 5X SSC。

探针杂交

1. 去除 EZ-Batch™ 载玻片夹中的载玻片上多余的液体，滴加 4-6 滴探针混合物，完全覆盖样本。

2. 将 EZ-Batch™ 载玻片夹放入 HybEZ ™ 湿盒，盖上盖，放入 HybEZ ™ 杂交炉。在 40° C 下孵育 2 小时。

3. 取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液的 EZ-Batch™ 清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片 2 分钟/ 2次。

杂交 AMP1

1. 从 5× SSC 中取出载玻片，并使用新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液清洗载玻片 1-2 次。

2. 去除载玻片上多余的液体，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代荧光 AMP1，完全覆盖样本。

3. 将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在 40° C 下孵育 30 分钟。

4. 取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液的 EZ-Batch™ 清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片 2 分钟/2次。

杂交 AMP2

1. 去除载玻片上多余的液体，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代荧光 AMP2，完全覆盖样本。

2. 将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在 40° C 下孵育 30 分钟。

3. 取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液的清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片 2 分钟/2次。

杂交AMP3

1. 去除载玻片上多余的液体，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代荧光 AMP3，完全覆盖样本。

2. 将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在 40° C 下孵育 15 分钟。

重要！ 在进行这一步骤期间，准备 TSA ® Plus 荧光染料。参考后续步骤。

3. 取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液的清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片 2 分钟/2次。

（无论同时检测几个 RNA 靶标，杂交 AMP1、AMP2 和 AMP3 的步骤都需要全部完成）

C1 通道探针的信号标记

1. 根据 Perkin Elmer 公司的 TSA ® Plus 荧光染料说明书，配置 TSA ® Plus FITC、TSA ® Plus Cy3 和 TSA ®Plus Cy5 荧光染料储备液。

2. 确定本次实验所需 TSA ® Plus 荧光染料的体积（每张载玻片 150-200 μL）。

3. 用 RNAscope ® 多通道二代荧光试剂盒提供的 TSA 缓冲液稀释 TSA ® Plus 荧光染料。

4.去除载玻片上多余的液体，滴加150-200 μL 稀释的TSA ® Plus FITC，完全覆盖样本。将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在 40° C 下孵育 30 分钟。

5. 用新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液洗涤载玻片，在室温下洗涤 2 分钟。用新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液重复此步骤。

6. 去除载玻片上多余的液体，滴加 4-6 滴 RNAscope ® 多通道二代荧光 HRP 阻断剂，完全覆盖样本。

7. 将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在 40° C 下孵育 15 分钟。

8. 取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液的清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片 2 分钟。用新鲜 RNAscope ® 1× 清洗缓冲液重复 1 次。

与其共染的免疫荧光染色技术（实验方法版权归廖师姐所有）

试剂：1*TBS：6.057 g Tris base, 8.7668 g NaCl to 1 L distilled water. PH 7.6.

TBST wash buffer: 500 ul 10% Tween 20+1L 1*TBS buffer.

TBS-10% BSA (BSA, Fraction V(ST023-50g), Beyotime) : 1g BSA to 100 ml 1*TBS.

方法：1. Wash slides 2 times/ 2 min in TBST wash buffer 轻柔搅动。

2. 10% 正常血清（山羊血清） in 1% BSA（TBS稀释） for 30 min at RT, or overnight at 4 ℃

3. 去除多余的封闭液（勿洗）

4. 一抗溶液稀释在1%BSA（TBS稀释）中，滴加与组织中45min，2h。RT/4℃，过夜。

5. TBST洗涤RT, 2次，5min

6. TBS-1%BSA 稀释2抗，2h。RT

7. 滴加DAPI 30s，去除DAPI后，封片。